In Vivo Real-time Positron Emission Particle Tracking (PEPT) And Single Particle PET - Nature Nanotechnology

Перевидано Платоном

читають: 0

Усі реагенти були використані в тому вигляді, в якому вони були отримані, якщо не вказано інше. Усі хімічні речовини були придбані у Sigma Aldrich, за винятком рахункових кульок (CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen). ζ-Потенціал вимірювали за допомогою Zetasizer NanoZS90 (Malvern Instruments). Розмір і морфологію частинок вивчали за допомогою SEM в мікроскопі JEOL JSM 7800F Prime з вбудованим EDS для забезпечення елементного аналізу. Розмір частинок визначали шляхом вимірювання 50 незалежних частинок. Радіомиттєва тонкошарова хроматографія (ITLC) була розроблена на папері Agilent Technologies для скляної мікроволокнистої хроматографії, просоченому кремнієвою кислотою, і проаналізована за допомогою сканера Lablogic Flow-count TLC і фотодетектора BioScan B-FC-3200 (ФЕУ) з використанням програмного забезпечення Laura. Рухома фаза ITLC складалася з 0.175 М лимонної кислоти та 0.325 М тринатрійцитрату у воді, якщо не зазначено інше. Радіоактивні зразки вимірювали за допомогою Capintec CRC-25R (Capintec) або LKB Wallac 1282 Compugamma CS (PerkinElmer), дані для яких збирали за допомогою програмного забезпечення EdenTerm. Експерименти з проточною цитометрією проводили в сортувальнику клітин BD FACSMelody за допомогою програмного забезпечення BD FACSChorus. Зображення ПЕТ/КТ отримували за допомогою сканера NanoPET/CT (Mediso), реконструювали за допомогою програмного забезпечення Nucline v.0.21, а зображення аналізували за допомогою програмного забезпечення VivoQuant (версія 3.5, InviCRO). Дані Listmode були отримані спеціальним програмним інструментом MATLAB, розробленим Mediso. Авторадіографію проводили на приладі GE Amersham Typhoon.

Синтез частинок кремнезему субмікрометрового розміру

Частинки були синтезовані методом Штебера. Цей метод заснований на гідролізі та послідовній конденсації алкоксидів кремнію для отримання монодисперсних сферичних частинок кремнезему.²⁷. Тетраетилортосилікат (TEOS) використовувався як джерело кремнію, аміак як основний каталізатор і хлорид калію як електроліт. До розчину, що містить каталізатор і електроліт, безперервно додавали розчин ТЕОС в етанолі. Модифікація початкової кількості реагенту або швидкості додавання забезпечує різницю в розмірі частинок, як повідомлялося раніше²⁸. Тут перед синтезом частинок було приготовано два розчини: розчин 1, що містить 19.0 ммоль TEOS у 33.3 мл EtOH, і розчин 2, що містить 0.23 ммоль KCl у 9 мл аміаку, 65 мл EtOH та 6.75 мл H.₂O. Для синтезу Розчин 2 поміщали в круглодонну колбу на 250 мл, нагріту при 50 °C при перемішуванні при 300 об/хв протягом 15 хв. Потім розчин 1 додавали по краплях до розчину 2 (швидкість подачі 0.2 мл хв^-1). Після додавання розчину 1 отримані частинки очищали центрифугуванням при 18,300g протягом 3 хв і промивають EtOH п'ять разів. Нарешті, SiO₂ мікрочастинки сушили під вакуумом.

Прищеплення частинок субмікрометрового розміру силаном-ПЕГ_5k

А 20 мг мл^-1 розчин силану–ПЕГ_5k (Sigma Aldrich) в EtOH 98% додавали до розчину smSiP при 5 мг мл^-1 в EtOH 98% і 2.8% аміаку. Суміш перемішували протягом ночі при кімнатній температурі, і частинки відновлювали центрифугуванням при 18,300°С.g протягом 3 хв. Нарешті, частинки тричі промивали дистильованою водою і сушили під вакуумом протягом ночі. Промивні розчини сушили заморожуванням протягом ночі, а кількість незв’язаного силану-ПЕГ_5k зважений для розрахунку виходу реакції. А 0.05 мг мл^-1 розчин smSiP–PEG_5k у дистильованій воді використовували для подальших реакцій радіомічення.

[⁶⁸Ga]GaCl₃

Галій-68 елюювався як [⁶⁸Ga]GaCl₃ від Екерта і Ціглера ⁶⁸Ge/⁶⁸Генератор Ga у надчистій HCl (4 мл, 0.1 М), виготовлений відповідно до вимог належної виробничої практики (ABX).

Концентрація [⁶⁸Ga]GaCl₃ елюція катіонним обміном

Концентрацію елюювання проводили за допомогою установки, описаної на Додатковій рис. 1. Спочатку 4 мл [⁶⁸Ga]GaCl₃ елюент завантажували на картридж Strata-XC 33u (Phenomenex), а елюат викидали. Потім картридж промивали 5 мл розчину ацетон/0.1 М HCl (80:20) і елюат відкидали. Нарешті, концентрований [⁶⁸Ga]GaCl₃ збирали шляхом додавання 700 мкл розчину ацетон/0.05 М HCl (98:2), сушили під N.₂ потоку та ресуспендують у 50 мкл 0.5 М буфера HEPES (pH 4.9). Радіо-ТСХ проводили на різних етапах для контролю якості. Протокол займає приблизно 20 хвилин, що забезпечує вихід 86.2 ± 8.5%.

Радіоактивне мічення частинок кремнезему при різних концентраціях с ⁶⁸Ga

Частинки кремнезему ресуспендували в різних концентраціях (від 1 до 0.002 мг мл^-1) в 0.5 М буфері HEPES (pH 4.9). Потім 50 мкл розчину додавали в реакційну пробірку перед додаванням концентрованої [⁶⁸Ga]GaCl₃ елюювання в 50 мкл 0.5 М буфера HEPES (pH 4.9). Реакції проводили при 90 °C протягом 30 хвилин, і для розрахунку радіохімічного виходу проводили радіо-ТСХ.

Вимірювання концентрації частинок методом проточної цитометрії

Концентрації частинок розраховували за допомогою проточної цитометрії з використанням лічильних кульок (CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen) відповідно до інструкцій виробника. Частинки кремнезему ресуспендували при 0.05 мг мл^-1, обробили ультразвуком протягом 10 хвилин і пропустили через фільтр з роздільною здатністю 10 мкм (шприцевий фільтр KX, нейлон, 25 мм, 10 мкм). Гранули CountBright Absolute Counting Beads нагрівали до кімнатної температури та перемішували протягом 30 секунд. Потім 50 мкл кульок додавали до 300 мкл частинок кремнезему і суміш перемішували протягом 30 хв для отримання однорідного розчину. Зразок перевіряли на проточному цитометрі, а поріг прямого розсіювання (FSC) встановлювали для включення кульок і частинок на графіку лінійного FSC проти лінійного розсіювання. Після цього напругу флуоресцентного детектора регулювали для лічильних кульок і застосовували стратегію стробування для ізоляції частинок кремнезему та популяції лічильних кульок. Нарешті, на частинках і кульках абсолютного підрахунку були намальовані ворота, і для кожного зразка було зареєстровано 1,000 подій кульок. Використовуючи цю стратегію, кількість частинок у розчині було розраховано за допомогою наступного рівняння:

$$begin{array}{l}displaystyle{mathrm{Absolute}},{mathrm{count}},left(frac{mathrm{Particles}}{{{upmu l}}}right)=displaystylefrac{({mathrm{ Частинки}},{mathrm{count}},times,{mathrm{Counting}},{mathrm{beads}},{mathrm{volume}})}{({mathrm{Counting}},{mathrm{beads}} ,{mathrm{count}},times,{mathrm{Particles}},{mathrm{volume}})} times,{mathrm{Counting}},{mathrm{beads}},{mathrm{concentration}}left(frac {{mathrm{Beads}}}{{{upmu l}}}right)end{array}$$

Радіоактивне мічення 500 smSiP

50 smSiP додавали до XNUMX мкл концентрованого [⁶⁸Ga]GaCl₃ елюювання в 0.5 М буфері HEPES рН 4.9. Потім додавали 5.6 мкл полісорбату 80 і суміш нагрівали при 90 °C протягом 30 хвилин при 900 об/хв у термозмішувачі. Після цього був розроблений остаточний багатоетапний протокол очищення для видалення непрореагованих/колоїдних ⁶⁸Ga. Додавали 10 мікролітрів 5 мМ EDTA і суміш інкубували 3 хвилин при кімнатній температурі. Потім частинки центрифугували протягом 18,300 хв при XNUMXg, ресуспендують у 500 мкл PBS, що містить 1 мМ EDTA + 0.1% полісорбату 80, і обережно перемішують протягом 10 с. Частинки знову центрифугували, промивали розчином 0.1 мМ EDTA + 0.1% полісорбату 80 у PBS і обережно перемішували протягом 10 с. Нарешті, частинки центрифугували і промивали ще п'ять разів PBS + 0.1% полісорбат 80 і ресуспендували в 500 мкл PBS. Реакцію радіомічення контролювали за допомогою радіо-ТСХ під час послідовних етапів реакції, щоб оцінити наявність колоїдів (які можна сплутати з частинками, якщо їх не видалити належним чином), радіомічення частинок і чистоту кінцевого продукту. RLY розраховували шляхом порівняння кількості радіоактивності в частинках і супернатантах після етапів промивання.

Фракціонування

Для стратегії фракціонування об’єми від 0.5 мкл до 20 мкл ⁶⁸Ga-smSiP при теоретичній концентрації 1 мкл частинки^-1 додавали в різні пробірки для зразків із кроком по 1 мкл (0.5, 1, 2, 3…) і додавали PBS, щоб довести кінцевий об’єм до 50 мкл. Потім 37.5 мкл з першої пробірки піпеткою перенесли в другу пробірку зі зразком, 25 мкл з другої пробірки в третю пробірку і, нарешті, 12.5 мкл з третьої пробірки в четверту пробірку. Ця стратегія забезпечує чотири пробірки на зразок із кінцевим об’ємом 12.5 мкл на пробірку. Радіоактивність у кожній пробірці вимірювали гамма-лічильником, а значення обчислювали в кБк за допомогою калібрувальної кривої для подальшого порівняння та аналізу. Зразки, що містять більшу частину радіоактивності лише в одній пробірці, обробляли ультразвуком протягом 30 секунд при кімнатній температурі та піддавали другому етапу фракціонування. Потім зразки, в яких виявлено всю радіоактивність в одній пробірці (з незначною активністю в інших трьох пробірках), використовували для подальших експериментів in vivo/ex vivo.

ПЕТ/КТ фантомне зображення

З одним було проведено експеримент із зображенням фантома ⁶⁸Ga-smSiP. Для доставки частинок у пробірку для зразків використовували канюлю, щоб оцінити, чи може одна частинка залишитися в пастці в трубці канюлі під час введення. Коротко кажучи, фантомну трубку помістили в наноПЕТ/КТ-сканер із кінцем наконечника канюлі, прикріпленим до трубки. Після початку отримання PET частинки, ресуспендовані в 100 мкл PBS, доставляли за допомогою інсулінового шприца, прикріпленого до початку канюлі. Потім канюлю промивали 50 мкл PBS, щоб забезпечити доставку частинок у фантомну трубку. Отримання ПЕТ проводилося протягом 2 годин з подальшим стандартним КТ.

ПЕТ/КТ зображення in vivo

Дослідження зображень на тваринах були етично перевірені та проведені відповідно до Закону про тварин (наукові процедури) 1986 року (ASPA) Міністерства внутрішніх справ Великобританії, що регулює експерименти на тваринах. Візуалізацію in vivo проводили на здорових 8-тижневих мишах BALB/c. Тварин анестезували ізофлураном (2–3% у кисні), канюлювали та поміщали на ліжко сканера під анестезією. Ліжко нагрівали до 37 °C за допомогою внутрішнього потоку повітря, щоб підтримувати нормальну температуру тіла тварини, і частоту дихання контролювали та підтримували на рівні 60–80 вдихів за хвилину.^-1 протягом усього сканування. Важливо контролювати температуру тварини, оскільки несподіване зниження температури може призвести до зниження швидкості частинок у крові. Один ⁶⁸Ga-smSiP (n = 4) або ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k частинка (n = 2) вводили через канюлю в 100 мкл PBS з подальшим промиванням 50 мкл PBS після початку отримання PET (режим збігу 1:5; вікно часу збігу 5 нс). ПЕТ записували протягом 2 год, а потім проводили напівкруглу КТ. Температуру тіла тварин і частоту дихання контролювали протягом усього процесу. Динамічні зображення ПЕТ/КТ були реконструйовані за допомогою реконструкції Tera-Tomo 3D (енергетичне вікно 400–600 кеВ, режим збігу 1:5, 20 ітерацій та 1 піднабір) із розміром вокселя 0.4 × 0.4 × 0.4 мм³ з поправкою на затухання, розсіювання та загасання. Можна знайти дані в режимі списку для всіх отримань PET/PEPT ⁶⁸Ga-smSiP за посиланням. ²⁹ і для ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k за посиланням ³⁰.

Відстеження в реальному часі

Спочатку дані були експортовані зі сканера у форматі listmode (тобто у форматі з міткою часу та кристалічним індексом для виявлених фотонів збігу). Геометричне перетворення було застосовано для перетворення індексів кристала в одиниці вимірювання положення в мм. Бірмінгемський метод ітеративно обчислює MDP з підмножини всіх LoR. Це робиться шляхом відкидання LoR, які знаходяться далі, ніж задана відстань від MDP, оскільки вони, ймовірно, виникнуть через помилкові LoR, наприклад, LoR, які можуть походити від розкиду. MDP уточнюється з кожною ітерацією; кількість ітерацій фактично встановлюється f-фактор і відноситься до загальної кількості LoR, які використовуються для оцінки кінцевого положення частинки в цій підмножині (наприклад, f-фактор 0.5 означає, що ітераційний цикл завершиться, коли залишиться 50% LoR у підмножині). Кількість LoR, що використовується в підмножині, можна зменшити, щоб покращити часову вибірку (підмножини є послідовними за часом без перекриття) ціною збільшення невизначеності в позиції (додаткову інформацію про алгоритм можна знайти в Parker et al.⁵) Бірмінгемський метод використовувався для аналізу даних у режимі списку з ПЕТ-сканера. Для відстеження частинок у мишей використовували адаптивний розмір вибірки. Розмір вибірки було встановлено для досягнення балансу достатньої часової вибірки при мінімізації помилок позиціонування. Розмір вибірки від 100 до 200 LoR використовувався на ранніх етапах сканування (<60 с від початку сканування), з f = 0.1, що дає приблизно 1–5 с інтервали. За часів сканування > 60 с розміри зразків змінювалися між 1,000 і 2,000, що дало часові інтервали від 30 до 60 с залежно від експерименту in vivo. Кількість підрахунків, використаних для обчислення MDP (на останній ітерації), можна знайти, помноживши розмір вибірки на f- значення фактора. Ці параметри були засновані на попередньому досвіді та на основі попередніх публікацій¹.

Швидкість була отримана як (sqrt{{v}_{x}^{2}+{v}_{y}^{2}+{v}_{z}^{2}}) де ({v}_{m}^{2}) є швидкістю в x, y та z напрямки.

Поглинання органом ex vivo

Поглинання в різних органах оцінювали за допомогою гамма-підрахунку. Після PET/CT візуалізації in vivo тварин вбивали через вивих шийки матки, а органи вирізали та зважували для підрахунку радіоактивності в гамма-лічильнику (LKB Wallac 1282 Compugamma CS). Дані були виражені у відсотках введеної дози (доза в органі/загальна введена доза) на грам тканини (% ID g^-1).

Авторадіографія

Радіоактивність у легенях відстежували за допомогою радіаційного детектора (зонд EP15, Morgan), і легені розрізали скальпелем на невеликі ділянки до отримання невеликої частини тканини з радіоактивним сигналом. Тканина була швидко заморожена в ізопропанолі при -80 °C. Одразу після заморожування тканину помістили в середовище з оптимальною температурою різання та нарізали в кріостаті на шматочки 20 мкм. Кожен зріз досліджувався детектором, доки не було знайдено радіоактивний зріз. Попередній (нижче фону), радіоактивний і наступний (нижче фону) зрізи помістили на предметне скло мікроскопа Superfrost (Epredia). Решта тканини, що залишилася, також була нижче фону. Предметне скло мікроскопа з трьома секціями накривали харчовою плівкою та виставляли на ніч на авторадіографічній пластині GE. Планшет аналізували за допомогою GE Amersham Typhoon з роздільною здатністю 25 мкм і налаштуванням PMT 4,000. Авторадіографічне зображення накладалося на зображення тканини, показуючи одну пляму радіоактивності в радіоактивному зрізі. Для кількісного визначення стандарти були підготовлені в різних відомих активностях, і кожен був позначений як 1 мкл квінтет на папері. Плями інкубували в тому самому накопичувальному люмінофорному екрані, BAS-IP MS (багатоцільовий стандарт) від GE, як кількісне визначення окремих частинок. Зображення було отримано за допомогою Amersham Typhoon 5 із програмним забезпеченням керування версії 2.0 у режимі люмінофора з розміром пікселя 100 мкм і чутливістю 4,000. Зображення кількісно оцінювали за допомогою програмного забезпечення ImageQantTL v10.0-261 з використанням інструментарію кількісного визначення гелю. Плями були виправлені шляхом вибору області безпосередньо перед або після плями як постійного фону. Отриманий об'єм плями використовувався для розрахунку Бк у частинці на основі калібрувальної кривої.

Статистика і відтворюваність

Для кількісного аналізу було проаналізовано мінімум три біологічні повтори, за винятком даних in vivo ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k (n = 2). Дані були проаналізовані за допомогою звичайного одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA) з тестом множинних порівнянь Даннетта та Стьюдента. t-тест. А P значення <0.05 вважалося статистично значущим.