Звірята
Експерименти проводилися відповідно до Керівництва Національного інституту охорони здоров'я щодо догляду та використання лабораторних тварин. Протоколи були схвалені місцевим комітетом з етики тварин (Комітет Чарльза Дарвіна № 5, реєстраційні номери 9529 і 26889) і проведені відповідно до Директиви 2010/63/ЄС Європейського парламенту. Самці щурів Лонг-Еванс віком від 2 до 12 місяців і самці мишей WT (C57BL/6J) віком 9 тижнів були отримані від Janvier Laboratories; Трансгенних самців щурів P23H (лінія 1) (9–22 місяців) вирощували локально.
Клонування плазмід і виробництво AAV
Плазміди, що містять E. coli mscL послідовність у формі WT і з мутацією G22S були отримані від Francesco Difato (плазміди Addgene #107454 і #107455)28. Для націлювання на RGC, промотор SNCG31 була вставлена в плазміду каркасу AAV, що містить mscL послідовність, злита з геном tdTomato та експортним сигналом Kir2.1 ER, щоб керувати експресією на плазматичній мембрані. Вектор AAV2.7m8 використовувався для внутрішньосклоподібного пологів. Для націлювання на нейрони в кортикальних шарах V1 промотор SNCG було замінено промотором CamKII і обрано вектор AAV9.7m8. Рекомбінантні AAV були отримані методом котрансфекції плазмід, а отримані лізати були очищені очищенням йодиксанолом31.
США стимул
Використовувалися три сфокусовані ультразвукові перетворювачі з різними центральними частотами: 0.50 МГц (діаметр, Ø = 1.00″ = 25.4 мм; фокусна відстань, f = 1.25″ = 31.7 мм) (V301-SU, Olympus), 2.25 МГц (Ø = 0.50″ = 12.7 мм, f = 1.00″ = 25.4 мм) (V306-SU, Olympus) і 15.00 МГц (Ø = 0.50″ = 12.7 мм, f = 1.00″ = 25.4 мм) (V319-SU, Olympus), що відповідає числовій апертурі F/Ø = 1.25 і 2.00. Акустичні поля, випромінювані цими трьома сфокусованими перетворювачами, представлені на рис. 1 (моделювання) і розширені дані Рис. 3 (експериментальні вимірювання). Handyscope TiePie (HS5, TiePie Engineering) використовувався для отримання форми сигналу стимулу, який потім пропускався через радіочастотний підсилювач потужності 80 dB (VBA 230-80, Vectawave), підключений до перетворювача. Виходи тиску перетворювача (тиск у фокусі, тривимірні (3D) карти тиску) були виміряні в резервуарі з дегазованою водою за допомогою гетеродинного інтерферометра Руйєра–Дьєлесента.47. Стимули УЗД, що використовувалися для стимуляції ex vivo та in vivo, мали такі характеристики: частота повторення імпульсів 1 kHz із робочим циклом 50%, тривалість обробки ультразвуком від 10 до 200 ms та міжстимульний інтервал між 0.01 та 2.00 s. Піковий акустичний тиск коливався від 0.11 до 0.88 МПа, 0.30–1.60 МПа та 0.20–1.27 МПа для перетворювачів 0.50, 2.25 та 15.00 МГц відповідно. Відповідні розрахункові значення середньої інтенсивності просторового пікового імпульсу (Isppa) становили 0.39–25.14, 2.92–83.12 та 1.30–52.37 Вт см-2.
Доставка генів у склоподібне тіло та візуалізація сітківки
Щурам вводили наркоз48 та AAV суспензія (2 мкл), що містить від 8 до 14 × 1010 вірусних частинок, вводили в центр склоподібної порожнини. Через місяць було виконано флуоресцентне зображення tdTomato на введених очах за допомогою мікроскопа для зображення сітківки MICRON IV (Phoenix Research Laboratories) і Micron Discover v.2.2.
Записи MEA
Шматочки сітківки розплющували на фільтрувальній мембрані (Whatman, GE Healthcare Life Sciences) і поміщали на MEA (діаметр електрода 30 мкм; відстань 200 мкм; MEA256 200/30 iR-ITO, MultiChannel Systems), покритий полі-l-лізин (0.1%, Sigma), з RGC, спрямованими до електродів31. АМРА/каїнатний антагоніст глутаматного рецептора 6-ціано-7-нітрохіноксалін-2,3-діон (CNQX, 25 мкМ, Sigma-Aldrich), антагоніст глутаматного рецептора NMDA [3H]3-(2-карбоксипіперазин-4-іл)пропіл -1-фосфонова кислота (CPP, 10 мкМ, Sigma-Aldrich) і селективний агоніст метаботропного глутаматного рецептора III групи, l-(+)-2-аміно-4-фосфономасляну кислоту (LAP4, 50 мкМ, Tocris Bioscience) застосовували через перфузійну лінію. Світлові подразники доставлялися за допомогою цифрового мікродзеркального дисплея (Vialux; роздільна здатність 1,024 × 768), з’єднаного з білим світлодіодним джерелом світла (MNWHL4, Thorlabs), сфокусованим на площині фоторецептора (опромінення, 1 мкВт см-2). УЗ-датчики були з’єднані зі спеціально виготовленим сполучним конусом, наповненим дегазованою водою та встановленим на столику з приводом (PT3/M-Z8, Thorlabs), розташованому ортогонально над сітківкою. Відбитий сигнал чіпа MEA та сітківки реєструвався за допомогою пристрою US key (Lecoeur Electronique). Відстань між сітківкою і перетворювачем дорівнювала фокусній відстані перетворювача; це було перевірено часом польоту відбитого сигналу. Із записів RGC із 252 канальним попереднім підсилювачем і MC_Rack v. 4.6.2 (багатоканальні системи) спайки були відсортовані за допомогою програмного забезпечення Spyking CIRCUS 0.549. Відповіді RGC були проаналізовані за допомогою спеціальних сценаріїв, написаних у MATLAB (MathWorks 2018b) для класифікації як ON, ON–OFF або OFF, з індексом домінування відповіді50. Затримки розраховувалися як час між початком стимулу та максимумом похідної функції щільності спайків (SDF). Два класи клітин, що реагують на УЗД, були ідентифіковані на основі затримки — SL і LL — шляхом фіксації порогового значення, що дорівнює мінімальному розподілу затримки відповідей клітин NT на УЗД (45 ms). Ми визначили пікове значення A SDF для розрахунку тривалості відповіді, яка визначалася як інтервал часу між двома моментами часу, для яких SDF дорівнював A/e (де A це пік деполяризації та e є числом Ейлера). Фактор Фано, який кількісно визначає варіабельність кількості спайків, розраховували як відношення дисперсії кількості спайків до середнього значення. Евклідова відстань між двома активованими клітинами була зважена відповідно до максимальної швидкості запалювання клітин. Співвідношення кількості активованих клітин до розміру стимульованої ділянки на чіпі MEA було розраховано з урахуванням розміру фокальної плями УЗ для 2.25 і 15.00 МГц і розміру MEA для 0.50 МГц, оскільки фокусна пляма була більшою ніж MEA для цієї частоти. Центр відповіді оцінювався шляхом зважування максимальної швидкості спрацьовування кожної клітини за її відстанню до інших відповідних клітин, а зсув відповіді розраховувався як евклідова відстань між двома положеннями центру відповіді.
Внутрішньочерепні ін'єкції
Суспензії AAV вводили в праву півкулю у двох різних місцях у щурів (2.6 mm ML, 6.8 mm AP та 3.1 mm ML, 7.2 mm AP від брегми) або в одне місце у мишей (2.5 mm ML, 3.5 mm AP від брегми). брегма)48. Для ін’єкцій щурам суспензія (200 нл, що містить 0.2–8.0 × 1015 вірусні частинки) вводили на три різні глибини (1,100, 1,350 і 1,500 мкм від кортикальної поверхні) за допомогою мікрошприцевого контролера насоса (Micro4, World Precision Instruments), що працює зі швидкістю 50 нл хв.-1 і 10 мкл шприц Hamilton. У мишей суспензія AAV (1 мкл, що містить 0.2–8.0 × 1015 вірусні частинки) вводили на відстані 400 мкм від кортикальної поверхні зі швидкістю 100 нл хв.-1.
In vivo позаклітинні записи
Через місяць після ін’єкцій AAV невелика краніотомія (5 × 5 мм2) було виконано вище V1 у правій півкулі48. Флуоресценцію tdTomato перевіряли за допомогою мікроскопа для візуалізації сітківки MICRON IV і Micron Discover v. 2.2 (Phoenix Research Laboratories). Масив електродів µEcog із 32 ділянок (діаметр електродів 30 мкм; відстань між електродами 300 мкм; FlexMEA36, MultiChannel Systems) розташовували над трансфікованою областю або в подібній зоні для контрольних щурів. Запис MEA проводили за допомогою кремнієвого мікрозонда з 16 точками, нахиленого під кутом 45° до поверхні мозку (діаметр електрода 30 мкм; відстань 50 мкм; A1x16-5mm-50-703, NeuroNexus Technologies) і MC_Rack v. 4.6.2. MEA був просунутий на 1,100 мкм у кору за допомогою тривісного мікроманіпулятора (Sutter Instruments). УЗД-датчики були підключені до мозку за допомогою спеціально виготовленого сполучного конуса, наповненого дегазованою водою та УЗ-гелем на моторизованому столику. Відстань між корою і перетворювачем дорівнювала фокусній відстані перетворювача. Візуальні стимули генерувалися світловипромінювальним діодом із колімованим білим світлом (MNWHL4, Thorlabs), розміщеним на відстані 15 см від ока (4.5 мВт см-2 на рогівці). Записи були оцифровані за допомогою 32 канальних та 16 канальних підсилювачів (модель ME32/16-FAI-μPA, MultiChannel Systems). Записи µEcog аналізували за допомогою спеціально розроблених сценаріїв MATLAB, а записи MEA аналізували за допомогою програмного забезпечення Spyking CIRCUS і спеціально розроблених сценаріїв MATLAB. Тривалість відповіді розраховували як інтервал між двома моментами часу, в яких викликаний корковим потенціалом був рівний A/e. Активована область була визначена як область карти активації псевдокольору, на якій пікова деполяризація перевищувала рівень фонового шуму, розрахований як 2 × s.d. сигналу. Центр відповіді оцінювався шляхом зважування піку деполяризації кожного електрода за його відстанню від інших електродів. Його відносне зміщення при переміщенні УЗ-датчика розраховувалося як евклідова відстань двох положень. Для внутрішньокоркових записів затримку клітин оцінювали як час між початком стимулу та максимумом похідної SDF.
Хірургія для тестування поведінки in vivo
Мишам C57BL6J підшкірно вводили бупренорфін (0.05 мг кг-1) (Buprécare, Axience) і дексаметазон (0.7 мг кг-1) (Дексазон, Вірбак). Тварин анестезували ізофлураном (5% індукції та 2% підтримки, у суміші повітря/кисень), а голову голили та очищали антисептичним розчином. Голову тварин фіксували на стереотаксичній рамі з системою доставки ізофлурану та очною маззю, а на очі накладали чорну серветку. Температуру тіла підтримували на рівні 37 °С. Після місцевої ін’єкції лідокаїну (4 мг кг-1) (Laocaïne, Centravet), на шкірі був зроблений розріз. Два гвинти були закріплені в черепі після невеликої краніотомії (приблизно 5.0 × 5.0 мм2) проводили над V1 у правій півкулі (сталеве свердло 0.5 мм) і застосовували кортексний буфер. Кортекс був покритий пластиковим листом TPX (товщиною 125 мкм) і запечатаний стоматологічним акриловим цементом (Tetric Evoflow). Для поведінкових експериментів металевий стрижень (PhenoSys) для фіксації голови був приклеєний до черепа на лівій півкулі стоматологічним цементом (FujiCEM 2). Тварин поміщали в реанімаційну камеру з підшкірним введенням фізіологічної сироватки та мазі на очі (Офталон, Центравет). Під час післяопераційного моніторингу вводили бупренорфін.
Тести поведінки миші
Мишам вводили графік обмеження води, поки вони не досягли приблизно 80–85% своєї ваги. Після звикання до умов тесту36, мишей навчили реагувати на LS, виконуючи завдання добровільного виявлення: облизування водосвердла (тупа голка 18 калібру, приблизно 5 мм від рота) у відповідь на стимуляцію повного поля білим світлом (тривалістю 200 і 50 мс) ліве око (розширене за допомогою тропікаміду, Mydriaticum Dispersa) протягом 35 випробувань на тривалість стимуляції та, отже, 70 випробувань на день. Вода (~4 мкл) автоматично розподілялася через 500 мс після ввімкнення світла через відкалібровану водяну систему. Поведінковий протокол і виявлення облизування контролювалися спеціальною системою36. Наступні чотири дні (дводенна перерва під час вихідних) УЗ стимуляцію проводили на V1 протягом 50 мс при трьох різних значеннях тиску (0.2, 0.7 та 1.2 МПа). Ці значення тиску надавалися щодня в іншому порядку (35 проб кожне). Інтервали між пробами змінювалися випадковим чином і становили від 10 до 30 с. УЗД-датчик 15 МГц був з’єднаний із мозком за допомогою спеціально виготовленого сполучного конуса, наповненого водою та УЗ-гелем. Рівень успішності розраховували шляхом підрахунку кількості випробувань, у яких миші виконували передбачувані облизування (між початком стимулу та відкриттям водяного клапана). Передбачувана швидкість злизування (рис. 6e) для сеансу розраховували шляхом віднімання від передбачуваної швидкості лизання пробної швидкості спонтанного лизання (розрахованої на всіх 1 s часових вікнах до кожного окремого початку стимулу (рис. 6a) для всіх випробувань) і множення на коефіцієнт успіху. Затримку лизання розраховували шляхом визначення часу до першого передбачуваного лизання після початку стимулу. У мишей, взятих для аналізу, рівень успіху був вищим або рівним 60% на четвертий день після LS. Потім легкі або ультразвукові сеанси, що демонструють компульсивну поведінку лизання, були виключені на основі ідентифікації викидів, зробленої за допомогою методу ROUT (Q = 1%) від частоти спонтанного облизування під час сеансу, усереднюючи вимірювання на всіх пробах сеансу в 1-му часовому вікні перед початком стимулу випробування.
Імуногістохімія та конфокальна візуалізація
Зразки інкубували протягом ночі при 4 °C з моноклональним анти-RBPMS антитілом (1:500, кролик; ABN1362, Merck Millipore) для сітківки.31, з моноклональним антитілом до NeuN (1:500, миша, клон A60; MAB377, Merck Millipore) для зрізів мозку48. Потім зрізи інкубували з вторинними антитілами, кон’югованими з Alexa Fluor 488 (1:500, ослячий антимишачий і ослячий антикролячий IgG 488, поліклональний; A-21202 і A-21206, Invitrogen, відповідно) і DAPI (1:1,000). ; D9542, Merck Millipore) протягом 1 год при кімнатній температурі. Конфокальний мікроскоп Olympus FV1000 з об’єктивом ×20 (UPLSAPO 20XO з числовою апертурою 0.85) використовувався для отримання зображень плоских сітківок і зрізів головного мозку (програмне забезпечення FV10-ASW v. 4.2).
На конфокальних зображеннях, оброблених за допомогою Fiji (ImageJ v. 1.53q), RBPMS- і NeuN-позитивні клітини автоматично підраховувалися за допомогою плагіна «analyze particles». Клітини були підраховані вручну двома різними користувачами за допомогою плагіна «лічильник клітин». Кількісну оцінку проводили шляхом отримання конфокальних стеків принаймні в чотирьох випадково вибраних трансфікованих областях 0.4 мм2 (Розширені дані Рис. 1). Для нейронів V1 для кожної тварини був обраний сагітальний зріз мозку з найбільшою зоною флуоресценції tdTomato. Ділянка інтересу була визначена вручну у V1, а кількісне визначення було виконано принаймні в шести випадково вибраних областях 0.4 мм2.
Моделювання нагрівання тканин, спричинене США
Для оцінки теплових ефектів використовувався потрійний процес: (1) моделювання акустичних полів, створюваних трьома перетворювачами, з реалістичними акустичними параметрами; (2) перевірка того, що нелінійна акустика не відіграє важливої ролі в теплопередачі; і (3) реалістичне моделювання теплообміну та підвищення температури, викликаного у фокусі ультразвуком, у лінійному режимі для параметрів, які використовуються в цьому дослідженні.
Для нелінійного моделювання ми використовували набір інструментів k-Wave MATLAB, визначаючи геометрію перетворювача в трьох вимірах і використовуючи такі параметри для середовища розповсюдження (вода): швидкість звуку, c = 1,500 м с-1; об'ємна маса, ρ = 1,000 кг м-3; коефіцієнт нелінійності, B/A = 5; коефіцієнт ослаблення, α = 2.2 × 10-3 дБ см-1 МГц-y; частотний степеневий закон коефіцієнта ослаблення, y = 2 (посил. 51). Ми змоделювали квазімонохроматичні тривимірні хвильові поля, використовуючи довгі спалахи по 3 циклів; це дало нам максимальне поле тиску в трьох вимірах, а також форму хвилі у фокусі. Моделювання було відкалібровано шляхом регулювання вхідного тиску (збудження змодельованого перетворювача) для досягнення тиску у фокусі, виміряного в резервуарі для води реальними перетворювачами. Діаметр фокальної плями повної ширини на половині максимуму (FWHM) у x-y площині становила 4.360, 1.610 і 0.276 мм, а довжина великої осі в x-z площина становила 32.3, 20.6 і 3.75 мм для перетворювачів 0.50, 2.25 і 15.00 МГц відповідно (рис. 1б–г). Нелінійні ефекти оцінювали шляхом оцінки відносного гармонічного вмісту хвилі у фокусі. У прикладі фокусного перетворювача 15 МГц на рис. 1d, експериментальні та змодельовані сигнали у фокальній плямі порівнювали та виявилися дуже узгодженими (розширені дані, рис. 4a). Крім того, амплітуда другої гармоніки на 19.8 дБ нижче основної (20.9 дБ у змодельованому випадку), що означає, що якщо основна енергія E, друга гармоніка має енергію E/95 (розширені дані, рис. 4b). Тому ми можемо розумно знехтувати нелінійними ефектами в розрахунках теплових ефектів, оскільки вони становлять ~1% залученої енергії. Такі самі висновки були зроблені на 0.5 МГц і 15.0 МГц. Апроксимації лінійного поширення хвилі значно знизили обчислювальні витрати на моделювання. Моделювання лінійного розповсюдження проводилося за допомогою панелі інструментів Field II у MATLAB52,53, в монохроматичному режимі, з тими ж властивостями середовища, що й k-Wave (вода), щоб отримати тривимірні поля максимального тиску. Ці поля максимального тиску були використані для побудови члена джерела нагріву (Q_{mathrm{US}} = frac{{alpha _{mathrm{np}}p_{mathrm{max}}^2}}{{rho _mathrm{b}c_mathrm{b}}}), Де αnp – коефіцієнт поглинання мозку на розглянутій частоті (59.04 Np m-1 на 15 MHz, розраховано з αмозок = 0.21 дБ см-1 МГц-y та y = 1.18), об’ємна маса мозку ρмозок = 1,046 кг м-3, швидкість звуку мозку cмозок = 154 с-1 та pМакс є тривимірним полем максимального тиску. Потім цей вихідний термін був використаний у розв’язанні рівняння біотеплота Пенне (rho _{mathrm{brain}}C_{mathrm{brain}}timesfrac{{partial T}}{{partial t}} = mathrm{div}left( {K_mathrm{t}timesnabla T} right) – rho _{ mathrm{кров}}C_{mathrm{кров}}P_{mathrm{кров}}ліворуч ({T – T_mathrm{a}} праворуч) + Q) в k-Wave, де Cмозок – питома теплоємність крові (3,630 Дж кг-1 ° C-1), Kt теплопровідність мозку (0.51 Вт м-1 ° C-1), ρкров – густина крові (1,050 кг м-3), Cкров – питома теплоємність крові (3,617 Дж кг-1 ° C-1), Pкров – коефіцієнт перфузії крові (9.7 × 10-3 s-1), Ta – артеріальна температура (37 °С), Q = QUS + ρмозокγмозок та γмозок це теплоутворення мозкової тканини (11.37 Вт кг-1) (посил. 54,55). Початкову умову для температури мозку було встановлено T0 = 37 °C.
Це моделювання відповідає найгіршому сценарію стосовно заданого підвищення температури. (1) Акустичне розповсюдження моделюється лише у воді (неоцінене значення) з нижчим коефіцієнтом ослаблення (2.2 × 10-3 дБ см МГц-2.00), ніж мозок (0.59 дБ см МГц-1.27), навіть якщо частина розповсюдження відбувається всередині мозку. The pМакс карти, отже, переоцінені. (2) Теплове поглинання моделюється лише в тканині мозку з вищим коефіцієнтом поглинання (0.21 дБ см МГц-1.18), ніж вода, навіть якщо частина поля максимального тиску фактично знаходиться у воді конуса акустичного сполучення. тому QUS трохи переоцінюється. Ми відобразили температуру в трьох просторових вимірах і часі, а також шукали точку максимального підвищення температури (розширені дані, рис. 4c–f).
Статистичний аналіз
Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення Prism (Prism 9, GraphPad). Значення виражені та представлені як середні значення ± стандартна похибка середнього (s.e.m.) на малюнках і в тексті, якщо не вказано інше. Дані були проаналізовані в непарних Велча t-тести (двосторонні) або непарний кратний t-тест із поправкою Сідака–Бонферроні для кількох порівнянь. Статистичні тести подано в легендах до рисунків.
Підсумок звітності
Більш детальна інформація про розробку досліджень доступна в Короткий звіт про портфоліо природи пов'язана з цією статтею.
- Розповсюдження контенту та PR на основі SEO. Отримайте посилення сьогодні.
- Платоблокчейн. Web3 Metaverse Intelligence. Розширені знання. Доступ тут.
- джерело: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01359-6
- :є
- ][стор
- $UP
- 000
- 1
- 10
- 100
- 11
- 1996
- 2%
- 2017
- 2018
- 2020
- 2021
- 28
- 39
- 3d
- 7
- 70
- 8
- 9
- a
- вище
- академічний
- доступний
- За
- рахунки
- набувати
- придбання
- Активація
- діяльність
- насправді
- просунутий
- після
- у віці
- Угода
- AL
- Alexa
- ВСІ
- дозволяє
- аналіз
- Якір
- та
- тварина
- тварини
- антитіла
- прикладної
- затверджений
- приблизно
- ЕСТЬ
- ПЛОЩА
- масив
- стаття
- AS
- оцінка
- At
- Серпня
- автоматично
- доступний
- середній
- усереднення
- Вісь
- Хребет
- заснований
- основа
- BE
- оскільки
- перед тим
- нижче
- між
- Black
- кров
- тіло
- Brain
- Перерва
- буфера
- будувати
- by
- розрахований
- CAN
- потужність
- який
- випадок
- Клітини
- центральний
- центр
- камера
- Канал
- характеристика
- Чарльз
- чіп
- вибраний
- класів
- класифікація
- клацання
- комітет
- порівняний
- всеосяжний
- обчислення
- стан
- проводиться
- провідність
- підключений
- вважається
- беручи до уваги
- зміст
- контроль
- контроль
- контролер
- Відповідний
- відповідає
- Коштувати
- з'єднаний
- покритий
- виготовлений на замовлення
- цикл
- циклів
- дані
- Database
- день
- Днів
- певний
- визначаючи
- поставляється
- доставка
- Щільність
- Глибини
- дизайн
- виявлено
- Виявлення
- певний
- визначення
- розробка
- пристрій
- DID
- різний
- цифровий
- оцифровані
- розміри
- відкрити
- дисплей
- відстань
- розподіл
- Панування
- звертається
- управляти
- під час
- e
- кожен
- ефекти
- енергія
- Машинобудування
- підвищена
- помилка
- оцінка
- Ефір (ETH)
- етика
- Європейська
- Європейський парламент
- оцінюється
- Навіть
- приклад
- збуджений
- виключений
- досвід
- експорт
- виражений
- очей
- очі
- облицювання
- поле
- Поля
- Фіга
- Рисунок
- цифри
- заповнений
- фільтрувати
- стрілянина
- Перший
- фіксованою
- політ
- Сфокусувати
- увагу
- після
- для
- форма
- знайдений
- Четвертий
- FRAME
- частота
- від
- функція
- функціональний
- фундаментальний
- Крім того
- ge
- GE Healthcare
- генерується
- покоління
- геометрія
- даний
- Земля
- Group
- керівництво
- Гамільтон
- голова
- здоров'я
- охорона здоров'я
- вище
- дуже
- HTTPS
- людина
- i
- Ідентифікація
- ідентифікований
- IEEE
- зображень
- Зображеннями
- важливо
- in
- інкубований
- індивідуальний
- інформація
- початковий
- вхід
- інструменти
- інтерес
- залучений
- ЙОГО
- ключ
- лабораторія
- більше
- найбільших
- Затримка
- закон
- шарів
- Легенди
- довжина
- рівень
- облизування
- життя
- Life Sciences
- світло
- Лінія
- LINK
- пов'язаний
- місцевий
- локально
- розташований
- розташування
- місць
- Довго
- подивився
- made
- обслуговування
- основний
- вручну
- карта
- карти
- Маса
- матеріал
- максимальний
- MEA
- сенс
- вимірювання
- механічний
- середа
- Merck
- метод
- мишей
- micron
- Мікроскоп
- мінімальний
- суміш
- ML
- режим
- модель
- MOL
- моніторинг
- місяць
- місяців
- рот
- переміщення
- MS
- множинний
- Мутація
- National
- Національні інститути здоров'я
- природа
- мережу
- мереж
- Нейрони
- Нові
- наступний
- номер
- мета
- отримувати
- отриманий
- of
- Олімп
- on
- ONE
- відкриття
- операційний
- порядок
- Інше
- інакше
- за ніч
- параметри
- парламент
- частина
- Пройшов
- Peak
- виконанні
- фенікс
- фізичний
- частин
- Плазма
- пластик
- plato
- Інформація про дані Платона
- PlatoData
- Play
- підключати
- точка
- точок
- портфель
- розташовані
- позиції
- потенціал
- влада
- Точність
- представлений
- press
- тиск
- процес
- виробляти
- Вироблений
- програма
- властивості
- протокол
- протоколи
- за умови
- пульс
- насос
- Кролик
- піднятий
- ЩУР
- ставка
- співвідношення
- досягати
- досяг
- реальний
- реалістичний
- відновлення
- відображено
- про
- режим
- регіон
- райони
- Реєстрація
- замінити
- Звітність
- представлений
- дослідження
- науково-дослідні лабораторії
- дозвіл
- відповідно
- Реагувати
- відповідаючи
- відповідь
- REST
- відновлення
- відновлення
- обмеження
- в результаті
- Сітківка
- Зростання
- Роль
- Кімната
- раут
- s
- то ж
- сценарій
- розклад
- SCI
- наука
- НАУКИ
- scripts
- другий
- вторинний
- розділам
- обраний
- селективний
- Чутливість
- датчиків
- Послідовність
- сироватка
- Сесія
- сесіях
- комплект
- форми
- Сигма
- Сигнал
- сигнали
- Кремній
- аналогічний
- моделювання
- сайт
- SIX
- Розмір
- Шкіра
- Скибочка
- невеликий
- Софтвер
- рішення
- Звучати
- Source
- просторовий
- конкретний
- зазначений
- швидкість
- шип
- шипи
- Spot
- Поширення
- Стеки
- Стажування
- standard
- статистичний
- сталь
- стимул
- Вивчення
- успіх
- чудовий
- поверхню
- підвіска
- суспензії
- переключено
- система
- Systems
- бак
- Мета
- націлювання
- Завдання
- Технології
- тест
- Тести
- Що
- Команда
- Площа
- їх
- отже
- теплової
- Ці
- Томпсон
- тисячі
- три
- тривимірний
- поріг
- через
- час
- тканини
- до
- Інструменти
- навчений
- переклад
- суд
- випробування
- Правда
- ультразвук
- us
- використання
- користувачі
- v1
- підтверджено
- значення
- Цінності
- клапан
- VBA
- перевірка
- перевірено
- бачення
- природних умовах
- об'ємна
- W
- вода
- хвиля
- уїк-енд
- тижня
- вага
- ДОБРЕ
- який
- білий
- windows
- з
- в
- світ
- письмовий
- зефірнет