Animais
Os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os protocolos foram aprovados pelo Comitê Local de Ética Animal (Comitê Charles Darwin nº 5, registros nºs 9529 e 26889) e conduzidos de acordo com a Diretiva 2010/63/EU do Parlamento Europeu. Ratos machos Long-Evans com idades entre 2 e 12 meses e camundongos machos WT (C57BL/6J) com idades de 9 semanas foram obtidos dos Laboratórios Janvier; Ratos transgênicos machos P23H (linha 1) (9-22 meses) foram criados localmente.
Clonagem de plasmídeo e produção de AAV
Plasmídeos contendo o E. coli mscL sequência na forma WT e com a mutação G22S foram obtidas de Francesco Difato (plasmídeos Addgene #107454 e #107455)28. Para direcionar RGCs, o promotor SNCG31 foi inserido em um plasmídeo de espinha dorsal de AAV contendo o mscL sequência fundida com o gene tdTomato e o sinal de exportação Kir2.1 ER, para conduzir a expressão na membrana plasmática. Um vetor AAV2.7m8 foi usado para entrega intravítrea. Para direcionar neurônios nas camadas corticais V1, o promotor SNCG foi substituído pelo promotor CamKII e um vetor AAV9.7m8 foi escolhido. AAVs recombinantes foram produzidos pelo método de cotransfecção de plasmídeo e os lisados resultantes foram purificados por purificação de iodixanol31.
Estímulo americano
Foram utilizados três transdutores de US focados com diferentes frequências centrais: 0.50 MHz (diâmetro, Ø = 1.00″ = 25.4 mm; distância focal, f = 1.25″ = 31.7 mm) (V301-SU, Olympus), 2.25 MHz (Ø = 0.50″ = 12.7 mm, f = 1.00″ = 25.4 mm) (V306-SU, Olympus) e 15.00 MHz (Ø = 0.50″ = 12.7 mm, f = 1.00″ = 25.4 mm) (V319-SU, Olympus), correspondendo a aberturas numéricas de F/Ø = 1.25 e 2.00. Os campos acústicos irradiados por esses três transdutores focalizados são apresentados na Fig. 1 (simulações) e dados estendidos Fig. 3 (medidas experimentais). Um Handyscope TiePie (HS5, TiePie Engineering) foi usado para produzir a forma de onda do estímulo, que foi então passada por um amplificador de potência de RF de 80 dB (VBA 230-80, Vectawave) conectado ao transdutor. As saídas de pressão do transdutor (pressão no foco, mapas de pressão tridimensionais (3D)) foram medidas em um tanque de água desgaseificada com um interferômetro heteródino Royer-Dieulesaint47. Os estímulos de US utilizados para estimulação ex vivo e in vivo apresentaram as seguintes características: freqüência de repetição de pulso de 1 kHz com ciclo de trabalho de 50%, duração da sonicação entre 10 e 200 ms e intervalo interestímulo entre 0.01 e 2.00 s. As pressões acústicas de pico variaram de 0.11 a 0.88 MPa, 0.30 a 1.60 MPa e 0.20 a 1.27 MPa para os transdutores de 0.50, 2.25 e 15.00 MHz, respectivamente. Os valores estimados correspondentes da intensidade média do pulso de pico espacial (Isppa) foram 0.39–25.14, 2.92–83.12 e 1.30–52.37 W cm-2.
Entrega intravítrea de genes e imagem da retina
Os ratos foram anestesiados48 e suspensão de AAV (2 µl), contendo entre 8 e 14 × 1010 partículas virais, foi injetado no centro da cavidade vítrea. Um mês depois, imagens de fluorescência tdTomato foram realizadas nos olhos injetados, com um microscópio de imagem retinal MICRON IV (Phoenix Research Laboratories) e Micron Discover v.2.2.
gravações MEA
Pedaços de retina foram achatados em uma membrana de filtro (Whatman, GE Healthcare Life Sciences) e colocados em um MEA (diâmetro do eletrodo, 30 µm; espaçamento, 200 µm; MEA256 200/30 iR-ITO, MultiChannel Systems) revestido com poli-l-lisina (0.1%, Sigma), com RGCs voltados para os eletrodos31. Antagonista do receptor de glutamato AMPA/cainato 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona (CNQX, 25 μM, Sigma-Aldrich), o antagonista do receptor de glutamato NMDA [3H]3-(2-carboxipiperazin-4-il)propil -1-ácido fosfônico (CPP, 10 μM, Sigma-Aldrich) e um agonista seletivo do receptor de glutamato metabotrópico do grupo III, l-(+)-2-amino-4-fosfonobutírico (LAP4, 50 μM, Tocris Bioscience), foram aplicados em banho através da linha de perfusão. Os estímulos de luz foram entregues com um visor de microespelho digital (Vialux; resolução, 1,024 × 768) acoplado a uma fonte de luz de diodo emissor de luz branca (MNWHL4, Thorlabs) focada no plano do fotorreceptor (irradiância, 1 µW cm-2). Os transdutores de US foram acoplados a um cone de acoplamento personalizado preenchido com água desgaseificada e montado em um estágio motorizado (PT3/M-Z8, Thorlabs) colocado ortogonalmente acima da retina. O sinal refletido do chip MEA e da retina foi detectado com um dispositivo chave dos EUA (Lecoeur Electronique). A distância entre a retina e o transdutor foi igual à distância focal do transdutor; isso foi verificado com o tempo de voo do sinal refletido. A partir de gravações RGC com um pré-amplificador de 252 canais e MC_Rack v. 4.6.2 (MultiChannel Systems), os picos foram classificados com o software Spyking CIRCUS 0.549. As respostas RGC foram analisadas com scripts personalizados escritos em MATLAB (MathWorks 2018b) para classificação como ON, ON–OFF ou OFF, com o índice de dominância de resposta50. As latências foram calculadas como o tempo entre o início do estímulo e o máximo da derivada da função de densidade de pico (SDF). Duas classes de células que respondem ao US foram identificadas com base na latência - SL e LL - fixando um limiar igual ao mínimo da distribuição de latência das respostas das células NT ao US (45 ms). Determinamos o valor máximo A do SDF para o cálculo da duração da resposta, que foi definida como o intervalo de tempo entre os dois pontos de tempo para os quais o SDF foi igual a A/e (Onde A é o pico de despolarização e e é o número de Euler). O fator Fano, que quantifica a variabilidade da contagem de picos, foi calculado como a razão entre a variância da contagem de picos e a média. A distância euclidiana entre duas células ativadas foi ponderada de acordo com a taxa máxima de disparo das células. A razão entre o número de células ativadas e o tamanho da área estimulada no chip MEA foi calculada considerando o tamanho do ponto focal US para 2.25 e 15.00 MHz e o tamanho do MEA para 0.50 MHz, pois o ponto focal era maior do que o MEA para esta frequência. O centro da resposta foi estimado ponderando a taxa máxima de disparo de cada célula por sua distância de outras células respondentes, e o deslocamento da resposta foi calculado como a distância euclidiana entre duas posições do centro de resposta.
Injeções intracranianas
Suspensões de AAV foram injetadas no hemisfério direito em dois locais diferentes em ratos (2.6 mm ML, 6.8 mm AP e 3.1 mm ML, 7.2 mm AP do bregma) ou em um local em camundongos (2.5 mm ML, 3.5 mm AP do bregma) bregma)48. Para injeções em ratos, a suspensão (200 nl contendo 0.2–8.0 × 1015 partículas virais) foi injetado em três profundidades diferentes (1,100, 1,350 e 1,500 µm da superfície cortical) com um controlador de bomba de microseringa (Micro4, World Precision Instruments) operando a uma taxa de 50 nl min-1 e seringa Hamilton de 10 µl. Em camundongos, a suspensão de AAV (1 µl contendo 0.2–8.0 × 1015 partículas virais) foi injetado a 400 µm da superfície cortical a uma taxa de 100 nl min-1.
Registros extracelulares in vivo
Um mês após as injeções de AAV, uma pequena craniotomia (5 × 5 mm2) foi realizada acima de V1 no hemisfério direito48. A fluorescência tdTomato foi verificada com um microscópio de imagem retinal MICRON IV e Micron Discover v. 2.2 (Phoenix Research Laboratories). Um arranjo de eletrodos µEcog de 32 locais (diâmetro do eletrodo, 30 µm; espaçamento entre eletrodos, 300 µm; FlexMEA36, MultiChannel Systems) foi posicionado sobre a região transfectada ou em uma zona semelhante para ratos de controle. As gravações de MEA foram realizadas com uma microssonda de silício de 16 locais inclinada a 45° em relação à superfície do cérebro (diâmetro do eletrodo, 30 µm; espaçamento, 50 µm; A1x16-5mm-50-703, NeuroNexus Technologies) e MC_Rack v. 4.6.2. O MEA foi avançado 1,100 µm no córtex com um micromanipulador de três eixos (Sutter Instruments). Os transdutores de US foram acoplados ao cérebro com um cone de acoplamento feito sob medida, preenchido com água desgaseificada e gel de US em um estágio motorizado. A distância entre o córtex e o transdutor era igual à distância focal do transdutor. Os estímulos visuais foram gerados por um diodo emissor de luz colimado de luz branca (MNWHL4, Thorlabs) colocado a 15 cm de distância do olho (4.5 mW cm-2 na córnea). As gravações foram digitalizadas com amplificadores de 32 e 16 canais (modelo ME32/16-FAI-μPA, MultiChannel Systems). As gravações µEcog foram analisadas com scripts MATLAB desenvolvidos sob medida e as gravações MEA foram analisadas com o software Spyking CIRCUS e scripts MATLAB desenvolvidos sob medida. A duração da resposta foi calculada como o intervalo entre os dois pontos de tempo em que o potencial evocado cortical foi igual a A/e. A área ativada foi definida como a área do mapa de ativação de pseudocor sobre a qual a despolarização de pico excedeu o nível de ruído de fundo calculado como 2 × sd do sinal. O centro de resposta foi estimado ponderando o pico de despolarização de cada eletrodo por sua distância dos outros eletrodos. Seu deslocamento relativo ao mover o transdutor US foi calculado como a distância euclidiana das duas posições. Para registros intracorticais, a latência celular foi estimada como o tempo entre o início do estímulo e o máximo da derivada do SDF.
Cirurgia para testes comportamentais in vivo
Camundongos C57BL6J foram injetados por via subcutânea com buprenorfina (0.05 mg kg-1) (Buprécare, Axience) e dexametasona (0.7 mg kg-1) (Dexazone, Virbac). Os animais foram anestesiados com isoflurano (5% de indução e 2% de manutenção, em mistura ar/oxigênio) e a cabeça raspada e limpa com solução antisséptica. A cabeça dos animais foi fixada em uma armação estereotáxica com um sistema de entrega de isoflurano e pomada ocular, e um tecido preto foi aplicado sobre os olhos. A temperatura corporal foi mantida em 37°C. Após injeção local de lidocaína (4 mg kg-1) (Laocaïne, Centravet), foi feita uma incisão na pele. Dois parafusos foram fixados no crânio, após pequena craniotomia (aproximadamente 5.0 × 5.0 mm2) foi realizada acima de V1 no hemisfério direito (broca de aço de 0.5 mm) e um buffer de córtex foi aplicado. O córtex foi coberto com uma folha de plástico TPX (125 µm de espessura) e selado com cimento acrílico dental (Tetric Evoflow). Para experimentos comportamentais, uma barra metálica (PhenoSys) para fixação da cabeça foi então colada ao crânio no hemisfério esquerdo com cimento dental (FujiCEM 2). Os animais foram colocados em uma câmara de recuperação, com injeção subcutânea de soro fisiológico e pomada nos olhos (Ophtalon, Centravet). A buprenorfina foi injetada durante o monitoramento pós-operatório.
Testes comportamentais de camundongos
Os camundongos foram colocados em um cronograma de restrição de água até atingirem aproximadamente 80-85% de seu peso. Após a habituação às condições de teste36, camundongos foram treinados para responder a um LS realizando uma tarefa de detecção voluntária: lamber uma tromba d'água (agulha cega de calibre 18, aproximadamente 5 mm da boca) em resposta à estimulação de campo total com luz branca (200 e 50 ms de duração) de o olho esquerdo (dilatado com tropicamida, Mydriaticum Dispersa) durante 35 tentativas por duração de estimulação e, portanto, 70 tentativas por dia. Água (~4 μl) foi dispensada automaticamente 500 ms após o acendimento da luz, por meio de um sistema de água calibrado. O protocolo comportamental e a detecção de lambidas foram controlados por um sistema customizado36. Nos quatro dias seguintes (intervalo de dois dias durante o fim de semana), as estimulações de US foram aplicadas em V1 por 50 ms em três valores de pressão diferentes (0.2, 0.7 e 1.2 MPa). Esses valores de pressão foram entregues em uma ordem diferente a cada dia (35 tentativas cada). Os intervalos intertentativas variaram aleatoriamente e variaram entre 10 e 30 s. O transdutor de US de 15 MHz foi acoplado ao cérebro com um cone de acoplamento feito sob medida, preenchido com água e gel de US. A taxa de sucesso foi calculada contando o número de tentativas em que os camundongos realizaram lambidas antecipatórias (entre o início do estímulo e a abertura da válvula de água). A taxa de lambedura antecipada (Fig. 6e) para a sessão foi calculada pela subtração da taxa de lambidas antecipadas de uma tentativa, a taxa de lambidas espontâneas (calculada em todas as janelas de tempo de 1 s antes do início de cada estímulo individual (Fig. 6a) para todas as tentativas) e multiplicação pela taxa de sucesso. A latência da lambida foi calculada determinando o tempo para a primeira lambida antecipatória após o início do estímulo. Os camundongos retidos para análise apresentaram taxa de sucesso superior ou igual a 60% no quarto dia após o LS. Em seguida, foram excluídas as sessões de luz ou US que apresentavam comportamento compulsivo de lambedura com base na identificação de outliers feita pelo método ROUT (Q = 1%) na taxa de lambidas espontâneas da sessão, calculando a média das medições em todas as tentativas da sessão na janela de tempo de 1 s antes do início do estímulo da tentativa.
Imuno-histoquímica e imagem confocal
As amostras foram incubadas durante a noite a 4 °C com um anticorpo monoclonal anti-RBPMS (1:500, coelho; ABN1362, Merck Millipore) para a retina31, com um anticorpo monoclonal anti-NeuN (1:500, camundongo, clone A60; MAB377, Merck Millipore) para cortes cerebrais48. As seções foram então incubadas com anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor 488 (1:500, burro anti-rato e burro anti-coelho IgG 488, policlonal; A-21202 e A-21206, Invitrogen, respectivamente) e DAPI (1:1,000 ; D9542, Merck Millipore) por 1 hora em temperatura ambiente. Um microscópio confocal Olympus FV1000 com objetiva ×20 (UPLSAPO 20XO com uma abertura numérica de 0.85) foi usado para adquirir as imagens de retinas planas e seções cerebrais (software FV10-ASW v. 4.2).
Nas imagens confocais processadas com Fiji (ImageJ v. 1.53q), as células positivas para RBPMS e NeuN foram contadas automaticamente com o plug-in 'analisar partículas'. As células foram contadas manualmente por dois usuários diferentes, com o plugin 'cell counter'. A quantificação foi realizada adquirindo pilhas confocais em pelo menos quatro regiões transfectadas escolhidas aleatoriamente de 0.4 mm2 (Dados estendidos Fig. 1). Para os neurônios V1, a fatia cerebral sagital com a maior zona de fluorescência tdTomato foi selecionada para cada animal. Uma região de interesse foi definida manualmente em V1 e as quantificações foram realizadas em pelo menos seis regiões de 0.4 mm escolhidas aleatoriamente2.
Simulações de aquecimento de tecido induzido por US
Um processo triplo foi utilizado para estimar os efeitos térmicos: (1) simulação dos campos acústicos gerados pelos três transdutores, com parâmetros acústicos realistas; (2) verificação de que a acústica não linear não desempenhou um papel importante na transferência de calor; e (3) simulações realistas de transferência de calor e elevação de temperatura induzidas no foco por US em regime linear para os parâmetros utilizados neste estudo.
Para simulações não lineares, usamos a caixa de ferramentas k-Wave do MATLAB definindo a geometria do transdutor em três dimensões e usando os seguintes parâmetros para o meio de propagação (água): velocidade do som, c = 1,500 m s-1; massa volumétrica, ρ = 1,000 kg m-3; coeficiente de não linearidade, B/A = 5; coeficiente de atenuação, α = 2.2 × 10-3 dB cm-1 MHz-y; lei de potência de frequência do coeficiente de atenuação, y = 2 (ref. 51). Simulamos campos de ondas 3D quase monocromáticos usando rajadas longas de 50 ciclos; isso nos deu o campo de pressão máxima em três dimensões, bem como a forma de onda no foco. As simulações foram calibradas ajustando a pressão de entrada (excitação do transdutor simulado) para atingir a pressão no foco medida na caixa d'água com transdutores reais. O diâmetro do ponto focal de largura total na metade do máximo (FWHM) no x-y plano foi de 4.360, 1.610 e 0.276 mm, e o comprimento do eixo maior no x-z plano foi de 32.3, 20.6 e 3.75 mm para os transdutores de 0.50, 2.25 e 15.00 MHz, respectivamente (Fig. 1b-d). Os efeitos não lineares foram avaliados estimando o conteúdo harmônico relativo da forma de onda no foco. No exemplo do transdutor de foco de 15 MHz na Fig. 1d, os sinais experimentais e simulados no ponto focal foram comparados e considerados altamente concordantes (Dados Estendidos Fig. 4a). Além disso, a amplitude do segundo harmônico está 19.8 dB abaixo da fundamental (20.9 dB no caso simulado), significando que se a energia fundamental for E, o segundo harmônico tem energia E/95 (Dados Estendidos Fig. 4b). Portanto, podemos razoavelmente desprezar os efeitos não lineares nos cálculos dos efeitos térmicos, pois eles representam ~1% da energia envolvida. As mesmas conclusões foram tiradas em 0.5 MHz e 15.0 MHz. As aproximações de propagação de onda linear diminuíram consideravelmente o custo computacional das simulações. Simulações de propagação linear foram realizadas com a caixa de ferramentas Field II no MATLAB52,53, no modo monocromático, com as mesmas propriedades médias do k-Wave (água), para obter os campos de pressão máxima 3D. Esses campos de pressão máxima foram usados para construir um termo de fonte de aquecimento (Q_{mathrm{US}} = frac{{alpha _{mathrm{np}}p_{mathrm{max}}^2}}{{rho _mathrm{b}c_mathrm{b}}}), Onde αnp é o coeficiente de absorção do cérebro na frequência considerada (59.04 Np m-1 a 15 MHz, calculado a partir de αcérebro = 0.21 dBcm-1 MHz-y e y = 1.18), a massa volumétrica cerebral ρcérebro = 1,046 kg m-3, a velocidade do som cerebral ccérebro = 154 segundos-1 e pmax é o campo de pressão máxima 3D. Este termo de origem foi então usado na resolução de uma equação de biocalor de Penne (rho _{mathrm{brain}}C_{mathrm{brain}}timesfrac{{parcial T}}{{parcial t}} = mathrm{div}esquerda( {K_mathrm{t}timesnabla T} direita) – rho _{ mathrm{sangue}}C_{mathrm{sangue}}P_{mathrm{sangue}}esquerda( {T – T_mathrm{a}} direita) + Q) na onda k, onde Ccérebro é o calor específico do sangue (3,630 J kg-1 ° C-1), Kt é a condutividade térmica do cérebro (0.51 W m-1 ° C-1), ρsangue é a densidade do sangue (1,050 kg m-3), Csangue é o calor específico do sangue (3,617 J kg-1 ° C-1), Psangue é o coeficiente de perfusão sanguínea (9.7 × 10-3 s-1), Ta é a temperatura arterial (37 °C), Q = QUS + ρcérebroγcérebro e γcérebro é a geração de calor do tecido cerebral (11.37 W kg-1) (ref. 54,55). A condição inicial para a temperatura cerebral foi definida como T0 = 37°C.
Esta simulação corresponde ao pior cenário em relação ao aumento de temperatura dado. (1) A propagação acústica é simulada apenas na água (valor não reduzido), com um coeficiente de atenuação menor (2.2 × 10-3 dB cm MHz-2.00) do que o cérebro (0.59 dB cm MHz-1.27), mesmo que uma parte da propagação ocorra dentro do cérebro. O pmax mapas são, portanto, superestimados. (2) A absorção térmica é simulada apenas no tecido cerebral, com um coeficiente de absorção maior (0.21 dB cm MHz-1.18) do que a água, mesmo que uma parte do campo de pressão máxima esteja realmente localizada dentro da água do cone de acoplamento acústico. Portanto, QUS está um pouco superestimado. Mapeamos a temperatura em três dimensões espaciais e temporais e procuramos o ponto de aumento máximo da temperatura (Dados Estendidos Fig. 4c-f).
Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas com o software Prism (Prism 9, GraphPad). Os valores são expressos e representados como valores médios ± erro padrão da média (sem) nas figuras e no texto, a menos que especificado de outra forma. Os dados foram analisados em Welch's não pareado t-testes (duas caudas) ou um múltiplo não pareado t-teste com correção de Sidak-Bonferroni para comparações múltiplas. Os testes estatísticos são fornecidos nas legendas das figuras.
Resumo de relatórios
Mais informações sobre projeto de pesquisa estão disponíveis no site Resumo do Relatório do Portfólio da Natureza vinculado a este artigo.
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- Fonte: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01359-6
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