동물
실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 가이드에 따라 수행되었습니다. 프로토콜은 지역 동물 윤리 위원회(Charles Darwin 5번 위원회, 등록 번호 9529 및 26889)의 승인을 받았으며 유럽 의회의 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었습니다. 2개월에서 12개월 사이의 Long-Evans 수컷 쥐와 57주령의 WT 수컷 쥐(C6BL/9J)는 Janvier Laboratories에서 구입했습니다. P23H(라인 1) 수컷 트랜스제닉 쥐(9-22개월)를 현지에서 키웠습니다.
플라스미드 클로닝 및 AAV 생산
포함하는 플라스미드 대장균 mscL WT 형태의 서열 및 G22S 돌연변이를 갖는 서열은 Francesco Difato(Addgene 플라스미드 #107454 및 #107455)로부터 얻었다.28. RGC를 표적으로 하기 위해 SNCG 프로모터31 포함하는 AAV 백본 플라스미드에 삽입되었습니다. mscL 원형질막에서 발현을 유도하기 위해 tdTomato 유전자 및 Kir2.1 ER 수출 신호에 융합된 서열. 유리체내 전달을 위해 AAV2.7m8 벡터를 사용하였다. V1 피질층의 뉴런을 표적화하기 위해 SNCG 프로모터를 CamKII 프로모터로 대체하고 AAV9.7m8 벡터를 선택했습니다. 재조합 AAV는 플라스미드 동시 형질감염 방법에 의해 생산되었고, 생성된 용해물은 요오딕사놀 정제에 의해 정제되었습니다.31.
미국 부양책
서로 다른 중심 주파수를 가진 0.50개의 집중 US 변환기가 사용되었습니다: XNUMXMHz(직경, Ø = 1.00″ = 25.4mm; 초점 거리, f = 1.25″ = 31.7mm)(V301-SU, 올림푸스), 2.25MHz(Ø = 0.50″ = 12.7mm, f = 1.00″ = 25.4mm)(V306-SU, Olympus) 및 15.00MHz(Ø = 0.50″ = 12.7mm, f = 1.00″ = 25.4mm)(V319-SU, Olympus), 개구수에 해당 F/Ø = 1.25 및 2.00. 이 XNUMX개의 집중된 변환기에 의해 방사되는 음향 필드는 그림 XNUMX에 나와 있습니다. 1 (시뮬레이션) 및 확장 데이터 Fig. 3 (실험 측정). TiePie Handyscope(HS5, TiePie Engineering)를 사용하여 자극 파형을 생성한 다음 변환기에 연결된 80dB RF 전력 증폭기(VBA 230-80, Vectawave)를 통과했습니다. 트랜스듀서 압력 출력(초점에서의 압력, 3차원(XNUMXD) 압력 맵)은 Royer-Dieulesaint 헤테로다인 간섭계가 있는 탈기된 물 탱크에서 측정되었습니다.47. 생체 외 및 생체 내 자극에 사용되는 US 자극은 다음과 같은 특성을 가졌습니다: 1% 듀티 사이클의 50kHz 펄스 반복 주파수, 10~200ms 사이의 초음파 처리 지속 시간 및 0.01~2.00s 사이의 자극 간 간격. 최대 음압은 0.11, 0.88 및 0.30MHz 트랜스듀서에 대해 각각 1.60~0.20MPa, 1.27~0.50MPa 및 2.25~15.00MPa 범위였습니다. 해당 추정 공간 피크 펄스 평균 강도(Isppa) 값은 0.39–25.14, 2.92–83.12 및 1.30–52.37 W cm- 2.
유리체내 유전자 전달 및 망막 이미징
쥐를 마취시켰다48 및 AAV 현탁액(2 μl), 8~14 × 1010 바이러스 입자를 유리체강 중앙에 주입했습니다. 한 달 후, 주입된 눈에 MICRON IV 망막 이미징 현미경(Phoenix Research Laboratories) 및 Micron Discover v.2.2를 사용하여 tdTomato 형광 이미징을 수행했습니다.
MEA 녹음
망막 조각을 필터 멤브레인(Whatman, GE Healthcare Life Sciences) 위에 평평하게 만들고 폴리-코팅된 MEA(전극 직경, 30μm; 간격, 200μm; MEA256 200/30 iR-ITO, MultiChannel Systems) 위에 놓았습니다.l-라이신(0.1%, 시그마), RGC가 전극을 향함31. AMPA/카이네이트 글루타메이트 수용체 길항제 6-시아노-7-니트로퀴녹살린-2,3-디온(CNQX, 25 μM, Sigma-Aldrich), NMDA 글루타메이트 수용체 길항제 [3H]3-(2-카르복시피페라진-4-일) 프로필 -1-포스폰산(CPP, 10 μM, Sigma-Aldrich) 및 선택적 그룹 III 대사성 글루타메이트 수용체 작용제, l-(+)-2-아미노-4-포스포노부티르산(LAP4, 50 μM, Tocris Bioscience)을 관류 라인을 통해 배스에 적용했습니다. 광자극은 광수용체 평면(방사조도, 1,024μW cm- 2). US 트랜스듀서는 탈기된 물로 채워진 맞춤형 커플링 콘과 결합되었고 망막 위에 직각으로 배치된 전동 스테이지(PT3/M-Z8, Thorlabs)에 장착되었습니다. MEA 칩과 망막의 반사 신호는 US Key Device(Lecoeur Electronique)로 검출하였다. 망막과 변환기 사이의 거리는 변환기의 초점 거리와 같았습니다. 이는 반사된 신호의 비행시간으로 확인하였다. 252채널 프리앰프와 MC_Rack v. 4.6.2(MultiChannel Systems)를 사용한 RGC 녹음에서 Spyking CIRCUS 0.5 소프트웨어로 스파이크를 정렬했습니다.49. RGC 응답은 응답 우위 지수를 사용하여 ON, ON-OFF 또는 OFF로 분류하기 위해 MATLAB(MathWorks 2018b)으로 작성된 사용자 지정 스크립트로 분석되었습니다.50. 대기 시간은 자극 개시와 스파이크 밀도 함수(SDF)의 도함수의 최대값 사이의 시간으로 계산되었습니다. US에 대한 NT 셀 응답의 대기 시간 분포의 최소값(45ms)과 동일한 임계값을 고정하여 대기 시간(SL 및 LL)에 기초하여 US 응답 셀의 두 클래스를 식별했습니다. 피크 값을 결정했습니다. A SDF가 다음과 같은 두 시점 사이의 시간 간격으로 정의된 반응 지속 시간 계산을 위한 SDF의 A/e (어디에 A 피크 탈분극이고 e 오일러의 수)입니다. 스파이크 수 변동성을 정량화하는 Fano 인자는 평균에 대한 스파이크 수의 분산 비율로 계산되었습니다. 활성화된 두 세포 사이의 유클리드 거리는 세포의 최대 발화율에 따라 가중되었다. 2.25MHz와 15.00MHz의 경우 US 초점의 크기, 0.50MHz의 경우 MEA의 크기를 고려하여 MEA 칩에 자극된 영역의 크기에 대한 활성화된 세포의 수의 비율을 계산했는데 이는 초점이 더 크기 때문입니다. 이 주파수에 대한 MEA보다 반응의 중심은 다른 반응 세포와의 거리에 따라 각 세포의 최대 발사 속도에 가중치를 부여하여 추정되었으며, 반응의 변위는 두 반응 중심 위치 사이의 유클리드 거리로 계산되었습니다.
두개내 주사
AAV 현탁액은 쥐의 두 가지 다른 위치(bregma에서 2.6mm ML, 6.8mm AP 및 3.1mm ML, 7.2mm AP) 또는 마우스의 한 위치(2.5mm ML, 3.5mm AP에서 오른쪽 반구로 주입되었습니다. 브레그마)48. 쥐 주사의 경우 현탁액(200–0.2 × 8.015 바이러스 입자)를 1,100 nl min 의 속도로 작동하는 마이크로시린지 펌프 컨트롤러(Micro1,350, World Precision Instruments)를 사용하여 세 가지 다른 깊이(피질 표면에서 1,500, 4 및 50 μm)에 주입했습니다.- 1 및 10 μl 해밀턴 주사기. 마우스에서 AAV 현탁액(1–0.2 × 8.015 바이러스 입자)를 400nl/분의 속도로 피질 표면으로부터 100μm에 주입했습니다.- 1.
생체 내 세포외 기록
AAV 주사 5개월 후, 작은 개두술(5 × XNUMX mm2)는 오른쪽 반구의 V1 이상에서 수행되었습니다.48. tdTomato 형광은 MICRON IV 망막 영상 현미경 및 Micron Discover v. 2.2(Phoenix Research Laboratories)로 확인했습니다. 32개 사이트 μEcog 전극 어레이(전극 직경, 30μm, 전극 간격, 300μm, FlexMEA36, MultiChannel Systems)를 트랜스펙션된 영역 위에 또는 대조군 쥐를 위한 유사한 영역에 배치했습니다. MEA 기록은 뇌 표면(전극 직경, 16μm, 간격, 45μm, A30x50-1mm-16-5, NeuroNexus Technologies) 및 MC_Rack v. 50에 대해 703°로 기울어진 4.6.2개 사이트 실리콘 마이크로프로브를 사용하여 수행되었습니다. MEA는 1,100축 미세 조작기(Sutter Instruments)를 사용하여 피질로 4μm 전진되었습니다. US 트랜스듀서는 전동 스테이지에서 탈기된 물과 US 젤로 채워진 맞춤형 커플링 콘으로 뇌에 연결되었습니다. 피질과 변환기 사이의 거리는 변환기의 초점 거리와 동일했습니다. 시각적 자극은 눈에서 15cm(4.5mW cm- 2 각막에서). 녹음은 32채널 및 16채널 증폭기(모델 ME32/16-FAI-μPA, MultiChannel Systems)로 디지털화되었습니다. µEcog 기록은 맞춤 개발된 MATLAB 스크립트로 분석되었고 MEA 기록은 Spyking CIRCUS 소프트웨어 및 맞춤 개발된 MATLAB 스크립트로 분석되었습니다. 반응 지속 시간은 피질 유발 전위가 다음과 같은 두 시점 사이의 간격으로 계산되었습니다. A/e. 활성화된 영역은 피크 탈분극이 신호의 2 × sd로 계산된 배경 잡음 수준을 초과하는 pseudocolor 활성화 맵의 영역으로 정의되었습니다. 응답 중심은 각 전극의 피크 탈분극에 다른 전극과의 거리를 가중하여 추정했습니다. US 변환기를 움직일 때의 상대 변위는 두 위치의 유클리드 거리로 계산되었습니다. 피질 내 기록의 경우, 세포 대기 시간은 자극 개시와 SDF 파생물의 최대값 사이의 시간으로 추정되었습니다.
생체 내 행동 검사를 위한 수술
C57BL6J 마우스에 부프레노르핀(0.05 mg/kg- 1) (Buprécare, Axience) 및 덱사메타손(0.7 mg/kg- 1) (덱사존, Virbac). 동물을 이소플루란(공기/산소 혼합물에서 5% 유도 및 2% 유지)으로 마취하고 머리를 면도하고 소독액으로 세척했습니다. 동물을 이소플루란 전달 시스템 및 눈 연고로 정위 프레임에 머리를 고정하고 검은 조직을 눈 위에 적용했습니다. 체온은 37 ° C로 유지되었습니다. 리도카인(4 mg kg- 1) (Laocaine, Centravet), 피부에 절개를 하였다. 작은 개두술(약 5.0 × 5.0 mm2)는 오른쪽 반구(1mm 강철 드릴)에서 V0.5 이상으로 수행되었으며 피질 버퍼가 적용되었습니다. 피질을 TPX 플라스틱 시트(두께 125μm)로 덮고 치과용 아크릴 시멘트(Tetric Evoflow)로 밀봉했습니다. 행동 실험을 위해 머리 고정을 위한 금속 헤드바(PhenoSys)를 치과용 시멘트(FujiCEM 2)로 왼쪽 반구의 두개골에 붙였습니다. 눈에 생리학적 혈청 및 연고(Ophtalon, Centravet)를 피하 주사하여 동물을 회복실에 두었다. 부프레노르핀은 수술 후 모니터링 중에 주입되었습니다.
마우스 행동 테스트
생쥐는 체중의 약 80-85%에 도달할 때까지 물 제한 일정에 놓였습니다. 테스트 조건에 따라 습관화36, 마우스는 자발적인 감지 작업을 수행하여 LS에 반응하도록 훈련되었습니다. 왼쪽 눈(트로피카미드, Mydriaticum Dispersa로 확장됨)은 자극 지속 시간당 18회 시행, 따라서 하루에 5회 시행합니다. 조명이 켜진 후 보정된 물 시스템을 통해 물(~200μl)이 자동으로 50ms에 분배되었습니다. 행동 프로토콜 및 핥기 감지는 맞춤형 시스템에 의해 제어되었습니다.36. 다음 1일(주말 동안 50일 휴식), 미국 자극은 세 가지 다른 압력 값(0.2, 0.7 및 1.2MPa)에서 35ms 동안 V10에서 전달되었습니다. 이러한 압력 값은 매일 다른 순서로 전달되었습니다(각각 30회 시도). 시험 간 간격은 무작위로 다양하며 15초에서 XNUMX초 사이입니다. XNUMXMHz US 변환기는 물과 US 젤로 채워진 맞춤형 커플링 콘으로 뇌에 연결되었습니다. 성공률은 마우스가 예상 핥기를 수행한 시도의 수를 세어 계산했습니다(자극 시작과 물 밸브 열림 사이). 예상 핥는 비율(그림. 6e) 세션의 경우 시험의 예상 핥기 비율, 자발적 핥기 비율(각 개별 자극이 시작되기 전 모든 1초 시간 창에서 계산됨(그림 XNUMX))에서 빼서 계산되었습니다. 6a) 모든 시행에 대해) 및 성공률을 곱합니다. 핥기 대기 시간은 자극 개시 후 첫 번째 예상 핥기까지의 시간을 결정하여 계산되었습니다. 분석을 위해 보관된 마우스는 LS 후 60일째에 XNUMX% 이상의 성공률을 나타냈다. 그런 다음 강박적인 핥기 행동을 보이는 가벼운 세션이나 US 세션은 ROUT 방법을 사용하여 만든 이상치 식별을 기반으로 제외되었습니다.Q = 1%) 시험의 자극 시작 전 1초 시간 창에서 세션의 모든 시험에 대한 측정을 평균화한 세션의 자발적인 핥기 비율.
면역조직화학 및 공초점 이미징
샘플을 망막에 대한 단일클론 항-RBPMS 항체(4:1, 토끼; ABN500, Merck Millipore)와 함께 1362°C에서 밤새 배양했습니다.31, 뇌 절편을 위한 단클론 항-NeuN 항체(1:500, 마우스, 클론 A60; MAB377, Merck Millipore)48. 절편을 Alexa Fluor 488(각각 1:500, 당나귀 항마우스 및 당나귀 항토끼 IgG 488, 폴리클로날; A-21202 및 A-21206, Invitrogen) 및 DAPI(1:1,000)와 접합된 9542차 항체와 함께 배양했습니다. ; D1, Merck Millipore) 실온에서 1000시간 동안. ×20 대물렌즈(개구수 20의 UPLSAPO 0.85XO)가 장착된 Olympus FV10 공초점 현미경을 사용하여 평면 장착 망막 및 뇌 절편의 이미지를 획득했습니다(FV4.2-ASW v. XNUMX 소프트웨어).
Fiji(ImageJ v. 1.53q)로 처리된 공초점 이미지에서 RBPMS- 및 NeuN-양성 세포는 '입자 분석' 플러그인으로 자동으로 계산되었습니다. 세포는 'cell counter' 플러그인을 사용하여 두 명의 다른 사용자가 수동으로 계산했습니다. 정량화는 0.4mm의 무작위로 선택된 XNUMX개 이상의 형질감염 영역에서 공초점 스택을 획득하여 수행되었습니다.2 (확장 데이터 그림. 1). V1 뉴런의 경우, 각 동물에 대해 가장 큰 tdTomato 형광 영역이 있는 시상 뇌 절편을 선택했습니다. 관심 영역은 V1에서 수동으로 정의되었으며 정량화는 0.4mm의 무작위로 선택된 최소 XNUMX개 영역에서 수행되었습니다.2.
미국 유도 조직 가열 시뮬레이션
열 효과를 추정하기 위해 1중 프로세스가 사용되었습니다. (2) 비선형 음향이 열 전달에서 중요한 역할을 하지 않는다는 확인; (3) 이 연구에서 사용된 매개변수에 대한 선형 체계에서 US에 의해 초점에서 유도된 열 전달 및 온도 상승의 현실적인 시뮬레이션.
비선형 시뮬레이션을 위해 트랜스듀서의 형상을 XNUMX차원으로 정의하고 전파 매체(물)에 대해 다음 매개 변수를 사용하여 MATLAB의 k-Wave 도구 상자를 사용했습니다. 음속, c = 1,500ms- 1; 체적 질량, ρ = 1,000kg·m- 3; 비선형성 계수, B/A = 5; 감쇠 계수, α = 2.2 × 10- 3 dB cm- 1 메가 헤르츠-y; 감쇠 계수의 주파수 전력 법칙, y = 2(참조. 51). 우리는 3주기의 긴 버스트를 사용하여 준단색 50D 파동장을 시뮬레이션했습니다. 이것은 우리에게 XNUMX차원의 최대 압력 필드와 초점에서의 파형을 제공했습니다. 시뮬레이션은 실제 변환기로 물 탱크에서 측정된 초점의 압력에 도달하도록 입력 압력(시뮬레이션된 변환기의 여기)을 조정하여 보정되었습니다. FWHM(full-width at half-maximum) 초점 직경 x-y 평면은 4.360, 1.610 및 0.276mm이고 장축의 길이는 x-z 평면은 32.3, 20.6 및 3.75MHz 트랜스듀서에 대해 각각 0.50, 2.25 및 15.00mm였습니다(그림. 1b~d). 비선형 효과는 초점에서 파형의 상대적 고조파 성분을 추정하여 평가되었습니다. 그림의 15MHz 초점 변환기 예에서. 1d, 초점에서 실험 신호와 시뮬레이션 신호를 비교한 결과 매우 일치하는 것으로 나타났습니다(Extended Data Fig. 4a). 또한 두 번째 고조파의 진폭은 기본 에너지보다 19.8dB 낮습니다(시뮬레이션된 경우 20.9dB). E, 두 번째 고조파는 에너지가 있습니다 E/95(확장 데이터 Fig. 4b). 따라서 관련 에너지의 ~1%를 차지하기 때문에 열 효과 계산에서 비선형 효과를 합리적으로 무시할 수 있습니다. 0.5MHz와 15.0MHz에서도 동일한 결론이 도출되었습니다. 선형 파동 전파 근사는 시뮬레이션의 컴퓨팅 비용을 상당히 줄였습니다. MATLAB의 Field II 도구 상자를 사용하여 선형 전파 시뮬레이션을 수행했습니다.52,53, 단색 모드에서 k-Wave(물)와 동일한 매체 속성을 사용하여 3D 최대 압력 필드를 얻습니다. 이러한 최대 압력 필드는 열원 항을 구축하는 데 사용되었습니다. (Q_{mathrm{미국}} = frac{{alpha _{mathrm{np}}p_{mathrm{max}}^2}}{{rho _mathrm{b}c_mathrm{b}}})어디로 αnp 고려된 주파수에서 뇌의 흡수 계수(59.04 Np m- 1 15MHz에서 계산 α뇌 = 0.21dBcm- 1 메가 헤르츠-y 및 y = 1.18), 뇌 체적 질량 ρ뇌 = 1,046kg·m-3, 뇌 소리 속도 c뇌 = 154초- 1 및 p최대 3D 최대 압력 필드입니다. 이 소스 용어는 Penne의 생체열 방정식의 해결에 사용되었습니다. (rho _{mathrm{brain}}C_{mathrm{brain}}timesfrac{{partial T}}{{partial t}} = mathrm{div}left( {K_mathrm{t}timesnabla T} right) – rho _{ mathrm{혈액}}C_{수학{혈액}}P_{수학{혈액}}왼쪽( {T – T_mathrm{a}} 오른쪽) + Q) k-Wave에서 C뇌 혈액 비열 용량(3,630 J kg- 1 ° C- 1), Kt 뇌 열전도율(0.51 W m- 1 ° C- 1), ρ피 혈액 밀도 (1,050 kg·m- 3), C피 혈액 비열 용량(3,617 J kg- 1 ° C- 1), P피 혈액 관류 계수(9.7 × 10- 3 s- 1), Ta 동맥 온도(37°C), Q = QUS + ρ뇌γ뇌 및 γ뇌 뇌 조직의 열 발생량(11.37 W kg- 1) (참조. 54,55). 뇌 온도의 초기 조건은 다음과 같이 설정되었습니다. T0 = 37°C.
이 시뮬레이션은 주어진 온도 상승에 관한 최악의 시나리오에 해당합니다. (1) 음향 전파는 낮은 감쇠 계수(2.2 × 10- 3 dB cm MHz- 2.00) 뇌보다 (0.59dB cm MHz- 1.27), 전파의 일부가 뇌 내에서 발생하는 경우에도 마찬가지입니다. 그만큼 p최대 따라서지도는 과대 평가됩니다. (2) 열 흡수는 더 높은 흡수 계수(0.21dB cm MHz)로 뇌 조직에서만 시뮬레이션됩니다.- 1.18) 최대 압력 필드의 일부가 실제로 음향 결합 콘의 물 내에 위치하더라도 물보다. 그러므로, QUS 약간 과대 평가됩니다. 세 가지 공간 차원과 시간으로 온도를 매핑하고 최대 온도 상승 지점을 찾았습니다(Extended Data Fig. 4c~f).
통계 분석
Prism 소프트웨어(Prism 9, GraphPad)를 사용하여 통계 분석을 수행했습니다. 값은 달리 명시되지 않는 한, 그림 및 본문에서 평균값 ± 평균(sem)의 표준오차로 표현 및 표시됩니다. 데이터는 페어링되지 않은 Welch's에서 분석되었습니다. t-테스트(양쪽 꼬리) 또는 짝이 없는 배수 t-다중 비교를 위해 Sidak–Bonferroni 보정으로 테스트합니다. 통계 테스트는 그림 범례에 제공됩니다.
보고 요약
연구 설계에 대한 추가 정보는 Nature 포트폴리오 보고 요약 이 기사에 링크되어 있습니다.
- SEO 기반 콘텐츠 및 PR 배포. 오늘 증폭하십시오.
- 플라토 블록체인. Web3 메타버스 인텔리전스. 지식 증폭. 여기에서 액세스하십시오.
- 출처: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01359-6
- :이다
- ][피
- $UP
- 000
- 1
- 10
- 100
- 11
- 1996
- 2%
- 2017
- 2018
- 2020
- 2021
- 28
- 39
- 3d
- 7
- 70
- 8
- 9
- a
- 위의
- 학술
- 액세스
- 에 따르면
- 계정
- 얻다
- 취득
- 활성화
- 활동
- 실제로
- 많은
- 후
- 세
- 협약
- AL
- 알렉사
- All
- 수
- 분석
- 닻
- 및
- 동물
- 동물
- 항체
- 적용된
- 인가 된
- 대략
- 있군요
- 지역
- 배열
- 기사
- AS
- 평가
- At
- 8월
- 자동적으로
- 가능
- 평균
- 평균화
- 축
- 등뼈
- 기반으로
- 기초
- BE
- 때문에
- 전에
- 이하
- 사이에
- 검정
- 피
- 몸
- 뇌
- 흩어져
- 버퍼
- 빌드
- by
- 계산 된
- CAN
- 생산 능력
- 한
- 케이스
- 셀
- 중심적인
- 센터
- 방
- 채널
- 특성
- 찰스
- 칩
- 선택
- 수업
- 분류
- 클릭
- 위원회
- 비교
- 포괄적 인
- 컴퓨팅
- 조건
- 실시
- 전도도
- 연결
- 고려
- 치고는
- 함유량
- 제어
- 통제
- 제어 장치
- 동
- 대응
- 비용
- 결합
- 적용
- 관습
- 주기
- 주기
- 데이터
- 데이터베이스
- 일
- 일
- 한정된
- 정의
- 전달
- 배달
- density
- 깊은 곳
- 디자인
- 탐지 된
- Detection System
- 결정된
- 결정
- 개발
- 장치
- DID
- 다른
- 디지털
- 디지털화
- 치수
- 발견
- 디스플레이
- 거리
- 분포
- 권세
- 그린
- 드라이브
- ...동안
- e
- 마다
- 효과
- 에너지
- 엔지니어링
- 강화
- 오류
- 예상
- 에테르 (ETH)
- 윤리학
- 유럽
- 유럽 의회
- 평가
- 조차
- 예
- 흥분한
- 제외
- 경험
- 수출
- 표현
- 눈
- 아이메이크업
- 마주보고
- 들
- Fields
- 무화과
- 그림
- 도
- 가득
- 필터링
- 발사
- 먼저,
- 고정
- 항공편
- 초점
- 집중
- 수행원
- 럭셔리
- 형태
- 발견
- 네번째
- FRAME
- 진동수
- 에
- 기능
- 기능의
- 기본적인
- 게다가
- ge
- GE 헬스 케어
- 생성
- 세대
- 기하학
- 주어진
- 육로
- 그룹
- 안내
- 해밀턴
- 머리
- 건강
- 건강 관리
- 더 높은
- 고도로
- HTTPS
- 사람의
- i
- 식별
- 확인
- IEEE
- 형상
- 영상
- 중대한
- in
- 배양
- 개인
- 정보
- 처음에는
- 입력
- 악기
- 관심
- 참여
- 그
- 키
- 실험실
- 큰
- 가장 큰
- 숨어 있음
- 법
- 레이어
- 전설
- 길이
- 레벨
- 대단히
- 생활
- 생명과학
- 빛
- 라인
- LINK
- 연결
- 지방의
- 장소 상에서
- 위치한
- 위치
- 위치
- 긴
- 보고
- 만든
- 유지
- 주요한
- 수동으로
- 지도
- 지도
- 질량
- 자료
- 최고
- MEA
- 의미
- 측정 시간 상관관계
- 기계적인
- 매질
- 머크
- 방법
- 생쥐
- 미크론
- 현미경
- 최저한의
- 혼합물
- ML
- 모드
- 모델
- 몰
- 모니터링
- 달
- 개월
- 입
- 움직이는
- MS
- 여러
- 변화
- 국가의
- 건강의 국립 연구소
- 자연
- 네트워크
- 네트워크
- 뉴런
- 신제품
- 다음 것
- 번호
- 목표
- 획득
- 획득
- of
- 올림포스 산
- on
- ONE
- 열기
- 운영
- 주문
- 기타
- 그렇지 않으면
- 밤새
- 매개 변수
- 의회
- 부품
- 합격
- 피크 (캐노피 지붕쪽)
- 실행할 수 있는
- 피닉스
- 물리적
- 개
- 혈장
- 플라스틱
- 플라톤
- 플라톤 데이터 인텔리전스
- 플라토데이터
- 연극
- 플러그인
- 포인트 적립
- 전철기
- 유가 증권
- 위치하는
- 위치
- 가능성
- 힘
- Precision
- 제시
- 키를 눌러
- 압박
- 방법
- 생산
- 생산
- 프로그램
- 속성
- 프로토콜
- 프로토콜
- 제공
- 펄스
- 펌프
- 토끼
- 높인
- 쥐
- 율
- 비율
- 도달
- 도달
- 현실
- 현실적인
- 회복
- 반영
- 에 관한
- 제도
- 지방
- 지역
- 등록
- 대체
- 통계 보고서
- 대표되는
- 연구
- 연구실
- 분해능
- 각기
- 응답
- 응답
- 응답
- REST
- 복구
- 복원
- 제한
- 결과
- 망막
- 상승
- 직위별
- 방
- 패주
- s
- 같은
- 대본
- 예정
- SCI
- 과학
- 과학
- 스크립트
- 둘째
- 보조
- 섹션
- 선택된
- 선택적
- 감도
- 센서
- 순서
- 세럼
- 세션
- 세션
- 세트
- 모양의
- 시그마
- 신호
- 신호
- 규소
- 비슷한
- 시뮬레이션
- 대지
- SIX
- 크기
- 피부
- 일부분
- 작은
- 소프트웨어
- 해결책
- 소리
- 출처
- 공간의
- 구체적인
- 지정
- 속도
- 스파이크
- 스파이크
- Spot
- 복음
- 스택
- 단계
- 표준
- 통계적인
- 스틸
- 자극
- 교육과정
- 성공
- 우수한
- 표면
- 현탁
- 정학
- 전환
- 체계
- 시스템은
- 탱크
- 목표
- 대상
- 태스크
- 기술
- test
- 테스트
- 그
- XNUMXD덴탈의
- 지역
- 그들의
- 따라서
- 열의
- Bowman의
- 톰슨
- 수천
- 세
- 삼차원의
- 임계값
- 을 통하여
- 시간
- 조직
- 에
- 도구 상자
- 훈련 된
- 이전
- 시도
- 시련
- 진실
- 초음파
- us
- 사용
- 사용자
- v1
- 검증 된
- 가치
- 마케팅은:
- 밸브
- VBA
- 확인
- 확인
- 시력
- 생체
- 체적의
- W
- 물
- 웨이브
- 주말
- 주
- 무게
- 잘
- 어느
- 화이트
- 창
- 과
- 이내
- 세계
- 쓴
- 제퍼 넷