מיקרו-אלקטרודות עם סרט דק המבוסס על גרפן ננו-נקבי עבור הקלטה וגירוי עצביים ברזולוציה גבוהה in vivo - Nature Nanotechnology

הכנת חומרים ואפיון

תמיסת GO מימית דוללה במים מפושטים לקבלת 0.15 mg ml^-1 תמיסה ומסוננת בוואקום דרך קרום ניטרוצלולוזה עם נקבוביות של 0.025 µm, ויוצרים סרט דק של GO. הסרט הדק הועבר לאחר מכן למצע היעד באמצעות העברה רטובה במים מופחתים וחישול תרמי נוסף ב-100 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. ערימת הסרט-מצע של GO הופחתה הידרותרמית ב-134 מעלות צלזיוס באוטוקלאב סטנדרטי למשך 3 שעות ליצירת EGNITE. המצע הבסיסי לכל מחקרי האפיון של EGNITE היה ריבוע (1 × 1  ס"מ²) של Si/SiO₂ (400 מיקרומטר/1 מיקרומטר).

XPS

מדידות XPS בוצעו עם מנתח Phoibos 150 (SPECS) בתנאי ואקום גבוה במיוחד (לחץ בסיס, 5 × 10^-10 mbar) עם מקור רנטגן Al Kα מונוכרומטי (1,486.74 eV). ספקטרום סקירה נרכשו עם אנרגיית מעבר של 50 eV וגודל צעד של 1 eV וספקטרום ברזולוציה גבוהה נרכשו עם אנרגיית מעבר של 20 eV וגודל צעד של 0.05 eV. הרזולוציה הכוללת באותם תנאים אחרונים היא 0.58 eV, כפי שנקבע על ידי מדידת הרוחב המלא בחצי המקסימום של Ag 3d5/2 שיא של כסף מנוזל. ניתוח XPS מראה ירידה חזקה לאחר הטיפול ההידרותרמי בשיא C–O (הקשור לקבוצות אפוקסיד), אך תרומה קטנה של C–OH, C=O ו-C(O)OH עקב הידרוקסילים, קרבונילים וקרבוקסילים אשר להישאר לאחר ההפחתה. דה-קונבולוציה של ה-O1s שיא מאשר התנהגות כזו. התרומה העיקרית ל-C1s האות לאחר ההפחתה ההידרותרמית, לעומת זאת, מגיע sp² אורביטלים C-C מוכלאים^34,57.

דיפרקציה בצילום רנטגן

מדידות עקיפה בקרני רנטגן (θ-2θ סריקה) בוצעו ב- Materials Research Diffractometer (Malvern PANalytical). דיפרקטומטר זה יש אופקי ω-2θ גווניומטר (רדיוס של 320 מ"מ) בגיאומטריה של ארבעה מעגלים ועבד עם צינור רנטגן קרמי עם אנודת Cu Kα (λ = 1.540598 Å). הגלאי המשמש הוא Pixcel שהוא גלאי רנטגן מהיר המבוסס על טכנולוגיית Medipix2.

ספקטרוסקופיה ראמן

מדידות ספקטרוסקופיה של ראמאן בוצעו באמצעות ספקטרוגרף Witec המצויד בקו עירור לייזר 488 nm. עבור המדידות, ספקטרום ראמאן נרכשו באמצעות מטרה של 50× ורשת של 600 חריצים לננומטר; כוח הלייזר נשמר מתחת ל-1.5 mW כדי למנוע חימום מדגם.

TEM

למלת קרן יונים ממוקדת הוכנה עם Helios NanoLab DualBeam (LMA-INA) למחקר חתך רוחב של מדגם EGNITE. ניתוחים מבניים בוצעו באמצעות TEM באמצעות מיקרוסקופ Tecnai F20 המופעל ב-200 kV, כולל HRTEM וטכניקות STEM של שדה כהה טבעתי בזווית גבוהה. ניסוי STEM-EELS בוצע במיקרוסקופ Tecnai F20 הפועל ב-200 KeV, עם צמצם של 5 מ"מ, אורך מצלמה של 30 מ"מ, זווית התכנסות של 12.7 מראד וזווית איסוף של 87.6 מרד. מכיוון שהשתמשנו ב-0.5 eV לפיקסל ו-250 eV כאנרגיית ההתחלה ברכישת אובדן הליבה, לא רכשנו את Si K-edge הצפוי ב-1,839 eV, את Pt M-edge ב-2,122 eV ואת Au M-edge ב- 2,206 eV. ההרכב האטומי היחסי C–O הושג על ידי מיקוד תשומת הלב שלנו בשכבת GO המופחתת והנחה שהקצוות שנותחו (C ו-O במקרה שלנו) מסתכמים ב-100%. הנחה זו תקפה בענייננו כפי שהוכח ב- מידע משלים מפות. חתך הפרש האנרגיה חושב באמצעות המודל של Hartree–Slater והרקע באמצעות מודל נמוך בהספק.

מוליכות חשמלית

מדידות מוליכות חשמלית בוצעו באמצעות מד מקור Keithley 2400 בתצורת שתי נקודות. הדגימות שנמדדו כללו סרטי EGNITE בגודל 1 × 1 ס"מ² על גבי SiO₂ מצע.

ניתוח נתונים

נתוני עקיפה של קרני רנטגן, ראמאן ו-XPS נותחו באמצעות חבילות Python 3.7 (Numpy, Pandas, Scipy, Xrdtools, Lmfit, Rampy, Peakutils, Matplotlib). המרחק בין המישורים חושב על פי מדידות עקיפה של קרני רנטגן על פי חוק סנל. לאחר שהנתונים הועברו לתחום המרחבי, הותאם המקסימום של הפסגות. המרחק המתאים נתן ערך ממוצע של המרחק בין המישורים. סטיות מאותם ערכים ממוצעים חושבו מהרוחב המלא בחצי המקסימום של ההתאמה לורנציאנית של הפסגות בתחום המרחבי. מדידות ספקטרוסקופיה של XPS ו-Raman נותחו על ידי התאמת קונבולוציה של פסגות על מיקומים צפויים עבור התכונות המקבילות. ערכי המוליכות של ה-GO ושל EGNITE הושגו על ידי התאמת ה- I-V עקומות שנמדדו במדידות המוליכות החשמלית לחוק אוהם. נתונים הם n = 1 לכל מדידה.

ייצור מערך גמיש

ייצור המכשירים מוצג באיור משלים. 4. התקנים יוצרו על 4 אינץ' Si/SiO₂ (400 μm/1 μm) פרוסות. ראשית, שכבה בעובי של 10 מיקרומטר של PI (PI-2611, HD MicroSystems) טופחה על הפרוסה ונאפתה באווירה עשירה בחנקן ב-350 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עקבות מתכתיים עוצבו באמצעות ליטוגרפיה אופטית של הפוטו-רזיסט להיפוך תמונה (AZ5214, Microchemicals). נידוף קרן אלקטרונים שימש להפקדת 20 ננומטר של טיטניום ו-200 של זהב ובוצעה הרמה. השתמשנו בסרט EGNITE בעובי של בסביבות 1 μm כפשרה בין ביצועים אלקטרוכימיים וגמישות המערך. לאחר העברת סרט ה-GO, האלומיניום התאדה באמצעות קרן אלקטרונית ואזורים על גבי המיקרו-אלקטרודות העתידיות הוגדרו על ידי שימוש בפוטו-רזיסט שלילי (nLOF 2070, Microchemicals) והתרימו. לאחר מכן, סרט ה-GO נחרט בכל מקום מלבד המיקרו-אלקטרודות העתידיות באמצעות תחריט יון תגובתי עם חמצן (RIE) למשך 5 דקות ב-500 W ועמודות האלומיניום המגינות נחרטו בתמיסה מדוללת של חומצות זרחתיות וחנקתיות. לאחר מכן, שכבה בעובי 3-מיקרומטר של PI-2611 הופקדה על הוופל ונאפתה כפי שתואר קודם לכן. פתחי PI-2611 על המיקרו-אלקטרודה הוגדרו לאחר מכן באמצעות פוטו-רזיסט עבה חיובי (AZ9260, Microchemicals) שפעל כמסכה עבור RIE חמצן שלאחר מכן. מאוחר יותר, המכשירים עוצבו על שכבת ה-PI, ​​שוב באמצעות AZ9260 photoresist ו-RIE. לאחר מכן הוסרה שכבת הפוטו-רזיסט באציטון והוופל נוקה באלכוהול איזופרופיל וייבש. לבסוף, המכשירים סולפו מהוואפר והיו מוכנים להצבה בשקיקי עיקור לטיפול הידרותרמי ב-134 מעלות צלזיוס באוטוקלאב סטנדרטי למשך 3 שעות.

אפיון אלקטרוכימי של מיקרואלקטרודות

אפיון אלקטרוכימי של המיקרו-אלקטרודות בוצע עם פוטנטיוסטט Metrohm Autolab PGSTAT128N ב-1× PBS (Sigma-Aldrich, P4417) המכיל 10 mM phosphate buffer, 137 mM NaCl ו-2.7 mM KCl ו-pH a. אלקטרודה Ag/AgCl (FlexRef, WPI) שימשה כאסמכתא וחוט פלטינה (Alfa Aesar, 7.4) שימש כאלקטרודה נגדית.

לפני הערכת הביצועים, אלקטרודות הופעמו עם 10,000 פולסים מאוזנים במטען (1'ms, 15'µA). חשיפת אלקטרודות לפרוטוקולי פעימה מתמשכים נמשכה ב-100 מחזורי וולטמטריה מחזוריים (-0.9 עד +0.8 V) ב-50 mV s^-1, 20 חזרות של 5,000 פולסים (1 ms) וקביעה מחדש של פוטנציאל המעגל הפתוח.

ניתוח נתונים

נתוני אפיון אלקטרוכימיים נותחו באמצעות חבילות Python 3.7 (Numpy, Pandas, Scipy, Pyeis, Lmfit, Matplotlib). נתוני ספקטרוסקופיה עכבה הותאמו למודל חשמלי שווה ערך המורכב מהתנגדות (R) בסדרה עם אלמנט פאזה קבועה (CPE). משם, ערך ה-CPE היה משוער לקיבול וחולק בשטח הגיאומטרי של המיקרואלקטרודה כדי לקבל ערך שווה ערך לקיבול הממשק של EGNITE. קיבול אחסון מטען של מיקרו-אלקטרודות (CSC) חושב ממדידות וולטמטריה מחזוריות על ידי שילוב המשטרים הקתודיים והאנודיים של הזרם הנמדד ונורמליזציה לפי קצב הסריקה. קיבולת אחסון המטען הקתודי והאנודי (cCSC ו-aCSC) בקצב סריקה של 100mV של EGNITE הם 45.9 ± 2.4 ו-34.6 ± 2.8 mC cm^-2, בהתאמה (n = 3). כפי שדווח לגבי חומרים אחרים⁵⁸, CSCs המתקבלים תלויים בקצב הסריקה (איור משלים. 5). כדי להעריך את נוכחותן של תגובות הפחתת חמצן, מדדנו את צורת הגל CV תחת אלקטרוליט מטוהר בחנקן⁵⁹ ולא ראה הבדלים מהותיים בצורת הגל (איור משלים. 6). עם זאת, התוצאות שלנו אינן מתייחסות במלואן להשפעה של תגובות הפחתת חמצן ביכולת הזרקת המטען של EGNITE ויש צורך לעשות עבודה נוספת כדי לחקור זאת כראוי. קיבולת הזרקת מטען מיקרו-אלקטרודה (CIC) נקבעה על ידי קביעת משרעת הפולס הנוכחית שחוללה הפרש מתח (לאחר הסרת הירידה האוהמית) שתואמת לחלון המים האלקטרוכימי האלקטרודה (-0.9 V עבור קתודי ו+0.8 V עבור anodic לעומת Ag/AgCl ) (איור משלים. 17)⁶⁰.

ניתוח סטטיסטי

הנתונים הם ממוצע ± s.d., n = 18 עבור EIS ו n = 3 עבור כרונופוטנציומטריות. הנתונים של מפת המתח הקיבולי הקתודי הם הממוצע של סטיות המתח הקיבוליות הקתודיות עבור אירוע אחד עבור כל צורת פולס של n = 3 אלקטרודות.

הערכת יציבות מכנית

בדיקת אולטרסאונד

מערכי אלקטרודות EGNITE הונחו בתוך כוס מלאה במים באמבט מים אולטרסאונד (Elmasonic P 180H). קולי הופעל ב-37 kHz למשך 15 דקות ב-200 W, ואחריו 15 דקות נוספות של sonication ב-37 kHz עם ההספק מוגבר ל-300 W. תמונות של אלקטרודות נרכשו לפני ואחרי שלבי הצליל.

מבחן כיפוף

מערך הכיפוף (איור. 2k) מורכב משלושה מוטות גליליים; האמצעי (קוטר, 700 µm) הונמך למטה, ויצר זוויות כיפוף של 131°. שלושה מערכי מיקרואלקטרודות גמישים שימשו לבדיקת הכיפוף. כל מערך הכיל 18 מיקרואלקטרודות בקוטר 50  מיקרומטר. שני מערכים נמדדו לאחר 10 ו-20 מחזורים בעוד מכשיר אחד נמדד רק במשך 10 מחזורים שכן הוא ניזוק במהלך הטיפול לאחר המדידה. מחזור בדיקת הכיפוף כלל הפעלת עומס באורך של 10 שניות פלוס 10 שניות ללא עומס. התקנים אופיינו מבחינה אלקטרוכימית (EIS ו-CV) לפני ואחרי 10 ו-20 מחזורי כיפוף.

רישום עצבי אפיקורטיקלי

השתלה אפיקורטיקלית

כל ההליכים הניסויים בוצעו בהתאם להמלצות של מועצת הקהילה האירופית והחקיקה הצרפתית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. הפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה האתית של גרנובל (ComEth) ואושרו על ידי המשרד הצרפתי (מספר 04815.02). חולדות ספראג-דאולי (זכר, בן 4 חודשים, במשקל ∼600 g) הורדמו תוך שרירית עם קטמין (50 mg לק"ג (משקל גוף)) ו-xylazine (10 mg לק"ג (משקל גוף)), ולאחר מכן הוצמדו למחזיק סטריאוטקסי. הסרת הגולגולת הזמנית חשפה את קליפת השמיעה. Dura mater נשמר כדי למנוע פגיעה ברקמה הקורטיקלית. נקדח חור בקודקוד כדי להכניס את אלקטרודת הייחוס, וחור שני, 7  מ"מ לכיוון הקדמי מהראשון, נקדח כדי להכניס את האלקטרודה הארקה. האלקטרודות היו פינים בעובי 0.5 מ"מ ששימשו לשקעי מעגל משולבים. הם הוצבו כדי ליצור מגע חשמלי עם ה-dura mater וקובעו לגולגולת בעזרת צמנט דנטלי. לאחר מכן הרכבנו את סרט המיקרו-אלקטרודה פני השטח על קליפת השמיעה כפי שמוצג באיור. 3b. דפוסי הוורידים מזהים את קליפת השמיעה, באזור 41 של מפת המוח של קריג. אותות קליפת המוח הוגברו בו זמנית בהגבר של 1,000 ועברו דיגיטציה בקצב דגימה של 33 kHz. רמקול 20 ס"מ מול אוזן של חולדה, בניגוד לקליפת המוח החשופה, העביר גירויים אקוסטיים. הגירויים שנמסרו נוטרו על ידי מיקרופון בגודל 0.25 אינץ' (Brüel & Kjaer, 4939) שהונח ליד האוזן והוצג ברמת לחץ קול (dB SPL re 20 μPa). אנו בוחנים את התגובות החיוביות לקודקוד (שלילי למעלה) עם זמן אחזור בינוני המתעוררות על ידי לחיצות מתחלפות ב-80 dB SPL, וגירויים של התפרצות טון ב-70 dB SPL עם תדרים הנעים בין 5 ל-40 kHz, זמן עלייה וירידה של 5 ms ו משך זמן של 200 שניות.

ניתוח נתונים

נתונים אלקטרופיזיולוגיים נותחו באמצעות חבילות Python 3.7 (Numpy, Pandas, Scipy, Neo, Elephant, Sklearn Matplotlib) והספרייה המותאמת אישית PhyREC (https://github.com/aguimera/PhyREC). ר.מ.ס. הערכים חושבו עם חלון הזזה של 20'ms בתדרים מעל 200'Hz. ספקטרוגרמות חושבו לטווח שבין 70 Hz ל-1.1 kHz. PSD חושב על פני 60 שניות של הקלטות רצופות. עבור מערך אלקטרודות נתון, חושבו שני PSDs: in vivo (IV) ואחרי המוות (PM). ה-SNR מבוטא ב-dB (20 × ln(r.m.s.(IV)/r.m.s.(PM))) ומועבר באינטרפולציה של 20 נקודות ברווח לוגריתמי בין 10 Hz ל-1 kHz.

ניתוח סטטיסטי

נתונים עצביים אפיקורטיים המוצגים באיור. 3 נלקחים ממידות בודדות על חיה בודדת. באיור. 3c, מוצגים נתונים מ-64 אלקטרודות. באיור. 3d, מוצגים נתונים משתי אלקטרודות נבחרות. באיור. 3f, ה-PSD וה-SNR מחושבים מ-64 אלקטרודות EGNITE ומוצגים כממוצע ± s.d. באיור משלים. 12ג,ד נתונים חציוניים מוצגים עבור 192 אלקטרודות EGNITE מ n = 3 ניסויים ו-60 אלקטרודות פלטינה מ n =  ניסוי אחד.

רישום עצבי תוך קורטיקלי

השתלה תוך קורטיקלית

בעלי חיים הורדמו עם תערובת של קטמין/קסילאזין (75:1, 0.35 ml/28 g i.p.) ומצב זה נשמר עם מסכת אינהלציה המספקת 1.5% איזופלורן. מספר ברגים מיקרו הוצבו לתוך הגולגולת כדי לייצב את השתל, וזה שעל גבי המוח הקטן שימש כקרקע כללית. הבדיקה הושתלה בקליפת המוח הקדם-מצחית (קואורדינטות: AP, 1.5 mm; ML, ±0.5 mm; DV, -1.7 mm מברגמה). ההשתלה בוצעה על ידי ציפוי הבדיקה במלטוז (ראה פרוטוקול להלן) כדי לספק קשיחות זמנית של הבדיקה ולהקל על החדרת הבדיקה. הגשושית אטומה במלט שיניים. מחברי TDT-ZifClip שימשו לחיבור הגשש למערכת האלקטרופיזיולוגית באמצעות כבל ממוזער. לאחר הניתוח, העכבר עבר תקופת החלמה של שבוע וקיבל טיפולים משכך כאבים (בופרנורפין) ואנטי דלקתיים (מלוקסיקם). פעילות עצבית תועדה עם מערכת Open Ephys רב-ערוצית בקצב דגימה של 1 kHz עם מגבר Intan RHD30. ניסויי המשימה השמיעתית נערכו בקופסה אטומה לרעש, עם שני רמקולים בפנים תוך שימוש בפרוטוקולים המבוססים על עבודה שתוארה קודם לכן⁶¹. גירוי הקול כלל מקליק של רעש לבן באורך 15 אלפיות השנייה, שחוזר על עצמו 100 פעמים (מחזורים), כל אחד מופרד ב-5  שניות (מרווח בין גירוי). במהלך המשימה, בעל החיים היה מסוגל לנוע בחופשיות.

פרוטוקול קשיח מלטוז

תמיסה מימית של מלטוז מחוממת עד לנקודת המעבר של הזכוכית (T_g), בין 130 ל-160 מעלות צלזיוס, באמצעות פלטה או מיקרוגל. ברגע שהמלטוז צמיג, הצד האחורי של הגשושית מובא במגע רק עם המלטוז. כאשר המלטוז מתקרר, הוא מקשיח ומקשיח את הגשש.

ניתוח נתונים

אותות עצביים מכל אלקטרודה סוננו במצב לא מקוון כדי לחלץ SUA ו-LFPs. SUA הוערך על ידי סינון האות בין 450 ל-6,000 Hz והקוצים מנוירונים בודדים מוינו באמצעות ניתוח רכיבים עיקריים עם Offline Sorter v.4 (Plexon). כדי להשיג LFPs, האותות הוקטנו ל-1 kHz, ניתקו וסונו חריצים כדי להסיר חפצי קו רעש (50 Hz וההרמוניות שלו) עם סקריפטים שנכתבו בהתאמה אישית ב-Python. AEP SNR חושב כיחס בין משרעת השיא של N1 וה-s.d. של תקופה של 20 שניות לפני הגירוי.

ניתוח סטטיסטי

הנתונים המוצגים באיור. 3 שעות, אני הם ממוצעים ± s.d., n = 30 כמספר הניסויים הממוצעים. נתונים שנרשמו מאותה אלקטרודה מוצגים בימים 30, 60 ו-90. נתונים מחיה בודדת מוצגים.

תאימות ביולוגית אפיקורטית כרונית

השתלה כירורגית של מכשירים

בסך הכל נעשה שימוש ב-27 חולדות בוגרות, זכרים, ספראג'-דאולי למחקר זה (נהר צ'רלס). בעלי חיים אוכסנו בטמפרטורת סביבה של 21 ± 2 °C ולחות של 40-50%, במחזור אור/12 שעות חשוך של 12 שעות. חולדות אוחסנו בקבוצות וקיבלו גישה חופשית לתזונה ולמים לאורך כל תקופת הניסוי. הליכים ניסויים בוצעו בהתאם לחוק רווחת בעלי חיים (1998), באישור משרד הפנים של בריטניה והגוף המקומי לביקורת אתית לרווחת בעלי חיים (AWERB). בעלי חיים הורדמו עם איזופלורן (2-3%) למשך הניתוח, ועומק ההרדמה נוטר על ידי בדיקת רפלקס צביטה בבוהן. בעלי חיים הונחו במסגרת סטריאוטקסית (Kopf, 900LS), הממוקמת מעל שמיכה תרמית כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. חור קרניוטומיה (∼5 mm ×4 mm) בוצע במרחק של 1 mm מקו האמצע באמצעות מקדחה דנטלית עם מקדחה של 0.9 mm, ה-dura הוסר והמכשיר האפיקורטיקלי הונח על משטח הקורטיקלי של המוח. חור הקרניוטומיה נאטם בקוויק-סיל, ואחריו צמנט דנטלי לאבטחה, והעור נתפר סגור. זריקות תת עוריות של תמיסת מלח (1 ml לק"ג (משקל גוף)) ובופרנורפין (0.03 mg לק"ג (משקל גוף)) ניתנו כדי להחליף נוזלים שאבדו ולהפחית את הכאב לאחר הניתוח, וההרדמה הופסקה.

איסוף רקמות ועיבוד

בעלי חיים הופסקו 2, 6 או 12 שבועות לאחר ההשתלה בשיטה מתאימה לסוג הניתוח שיש לבצע.

היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה

לאחר 2, 6 או 12 שבועות שלאחר ההשתלה חולדות הופסקו באמצעות זלוף לב עם הפריניזציה (10 U ml^-1, Sigma-Aldrich) PBS, ואחריו 4% פרפורמלדהיד (PFA, Sigma-Aldrich) ב-PBS. מוחות היו מקובעים לאחר מכן ב-4% PFA למשך 24 שעות, ואז הועברו ל-30% סוכרוז ב-PBS למשך 48 שעות לפחות לפני הקפאה באיזופנטן. לאחר מכן, המוח אוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס עד לחיתוך קריו ב-25 מיקרומטר. הרקמה נצבעה לאחר מכן עבור מולקולת מתאם קושר סידן מיונן 1 (Iba-1) כדי לקבוע את רמת ההפעלה של מיקרוגליה. בקצרה, קטעי רקמה נחסמו עם 5% סרום עיזים ב-PBS עם 0.1% Triton-X למשך שעה אחת לפני דגירה של לילה ב-1 מעלות צלזיוס עם הנוגדן העיקרי אנטי-Iba-4 (1:1, 1,000-019; Wako). החתכים נצבעו בנוגדן משני, אנטי-ארנב Alexa Fluor 19741 (594:1, A-400; Thermo Fisher) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. השקופיות הותקנו עם כיסויי כיסוי באמצעות אמצעי הרכבה נגד דהייה מסוג Prolong Gold עם 11012-diamidino-1-phenylindole (Thermo Fisher). הגשושית כיסתה שטח של 4,6 × 2 mm² על משטח הקורטיקלי של המוח; חלקי רקמה שנבחרו לצביעה כיסו 3.2 מ"מ באורך של אזור זה. השקופיות צולמו באמצעות סורק שקופיות מיקרוסקופ 3DHistech Pannoramic-250 ב-20× והתמונות נותחו באמצעות CaseViewer v.2.4 (3DHistech). כדי להעריך את הפעלת מיקרוגליה, שטח של 3.2 מ"מ כיסה, עם תמונה אחת נותחה כל 100 מ"מ. התמונות צולמו בהגדלה של 8.5× אשר פירטו קטע מאתר הבדיקה האפיקורטיקלית, 3 מ"מ מקו האמצע של המוח, המקיף את האזור ישירות מתחת לאתר הבדיקה.

עיבוד תמונה

נתוני המיקרוסקופיה עברו עיבוד תמונה באמצעות אלגוריתם לאפיון פנוטיפ מיקרוגליה (איור משלים. 13). הפעלת Microglial נותחה באמצעות CellProfiler* מותאם אישית (Broad Institute, v.3.1.9 מ- https://cellprofiler.org/) צנרת. ראשית, מודול EnhanceOrSuppressFeatures שימש לשיפור מבנים חוטיים כמו עצבים על ידי יישום שיטת שיפור הצינוריות. מהתמונות המשופרות, תאים חולקו באמצעות מודול IdentifyPrimaryObjects. מדידות ראשוניות של התאים העלו שטווח קוטר האובייקט המתאים היה 3-40 פיקסלים. חפצים מחוץ לטווח הקוטר הזה או שנוגעים בקצה התמונה הושלכו. התאים חולקו באמצעות אסטרטגיית סף אדפטיבית Otsu דו-מחלקה עם גודל חלון אדפטיבי של 50 פיקסלים. האובייקטים שזוהו על ידי מודול IdentifyPrimaryObjects הוקלטו למודול MeasureObjectSizeShape כדי לחשב את המאפיינים הדרושים לסיווג התא. במודול ClassifyObjects, הקטגוריה שעליה יש לבסס סיווגים צוינה להיות AreaShape, ו-Extent נבחרה כמדידה המתאימה. התאים סווגו כ "מופעל' או 'לא מופעל' על סמך מאפיין ה-Extent שלהם, שהוא היחס בין השטח התפוס על ידי התא לבין השטח שנכבש על ידי התיבה התוחמת שלו. גישת סיווג זו בוצעה רציונלית על ידי העובדה שלמיקרוגליות מופעלות יש גופי תאים גדולים וללא תהליכים, ולכן תופסות חלק גדול בהרבה מהקופסאות התוחמות שלהן מאשר לעמיתיהם הלא מופעלים. לבסוף, נעשה שימוש במודול CalculateMath ו-ExportToSpreadsheet כדי לחשב ולהוציא את הסטטיסטיקה הרצויה.

ניתוח סטטיסטי

מערכי נתונים הם n = 3 עבור כל סוג מכשיר (שתל PI בלבד (PI); PI עם זהב מיקרו מיוצר חשוף (זהב); ו-PI עם זהב מיקרו מיוצר ו-EGNITE (EGNITE) בכל נקודות הזמן) למעט זהב 6 שבועות שהוא n = 2 עבור נתוני ELISA. ההמיספרות הנגדיות שולבו בכל נקודת זמן כדי לתת n = 9 בשבועיים ו-2 שבועות לאחר ההשתלה ו n = 8 ב-6 שבועות לאחר ההשתלה. ניתוח הנתונים נעשה באמצעות תוכנת GraphPad Prism v.8. ניתוח סטטיסטי הושלם באמצעות ניתוח דו-כיווני של שונות (ANOVA) עם מבחן ההשוואות המרובות של Tukey במידת הצורך; P < 0.05 נחשב למשמעותי.

ELISA

לאחר תקופת ההשתלה, החיות הופסקו על ידי נקע בצוואר הרחם. רקמת המוח חולצה הן מהמיספרה הימנית והן השמאלית של המוח, הוקפאה בחנקן נוזלי ואוחסנה ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. רקמה עברה ליזה באמצעות חיץ תמוגה NP-40 (150  mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, 1% תחליף Nonidet P40, Fluka, pH מותאם ל-7.4) המכיל מעכב פרוטאז ופוספטאז (Halt Protease ו-Phosphatase Inhibitor Cocktail), Thermoock Fisher ואחריו שיבוש מכני של הרקמה (TissueLyser LT, Qiagen). לאחר מכן בוצעה צנטריפוגה של דגימות למשך 10 דקות ב-5,000 סל"ד, והסופרנטנט אוחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. לוח הדלקת של עכברוש LEGENDplex (מספר קטלוגי 740401, BioLegend), ערכת ELISA מרובה מבוססת חרוזים, הופעל כדי לכמת את הציטוקינים הבאים; IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-18, IL-33, CXCL1 (KC), CCL2 (MCP-1), מגרה מושבה גרנולוציטים-מקרופאגים גורם, אינטרפרון-γ וגורם נמק גידול. הערכה הופעלה לפי הוראות היצרן, כאשר חלבון נטען בנפח קבוע של 15 µl. לאחר דגירה עם סופרנטנט, החרוזים הופעלו על ציטומטר זרימה BD FACSVerse, והנתונים נותחו באמצעות תוכנת ניתוח נתונים LEGENDplex.

גירוי עצבי

השתלה תוך קסקולרית

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה האתית של Universitat Autònoma de Barcelona בהתאם להנחיית מועצת הקהילות האירופיות 2010/63/EU. בעלי חיים אוכסנו בטמפרטורה של 22 ± 2 °C תחת מחזור אור/12  שעות חשוך של 12 שעות עם מזון ומים זמינים באופן חופשי. העצב הסיאטי של חולדות ספראג-דאולי נקבות מורדמות (250-300 גרם, ∼בן 18 שבועות) נחשף בניתוח ואלקטרודות TIME הושתלו לרוחב על פני העצב הסיאטי בעזרת מחט ישרה המחוברת לחוט לולאה 10-0⁴⁶. התהליך נוטר תחת מיקרוסקופ דיסקציה כדי להבטיח את המיקום הנכון של האתרים הפעילים בתוך נקודות העצבים (איור 1). 4b). במהלך הניסויים, טמפרטורת גוף החיה נשמרה עם כרית חימום.

גירוי עצבי בוצע על ידי הפעלת רכבות של פולסי זרם דו-פאזיים באורך קבוע של 100 µs לפאזה והגדלת משרעת מ-0 ל-150 µA בצעדים של 1 או 3 µA ב-3 Hz למשך 33 s (סטימולטור DS4) מיקרואלקטרודות. במקביל, ה-CMAPs תועדו משרירי GM, TA ו-PL באמצעות אלקטרודות מחט קטנות (אורך 13 מ"מ, קוטר 0.4 מ"מ, אלקטרודות מחט נירוסטה A-03-14BEP, Bionic) שהוצבו בכל שריר⁶². האלקטרודה הפעילה הונחה על בטן השריר וההתייחסות בגובה הגיד. הקלטות אלקטרומיוגרפיה הוגברו (×100 עבור GM ו-TA, ×1,000 עבור PL; מגברי P511AC, Grass), סוננו בפס-פס (3 Hz עד 3 kHz) ועברו דיגיטציה עם מערכת הקלטה PowerLab (PowerLab16SP, ADInstruments) ב-kH20 .

ניתוח נתונים

המשרעת של כל CMAP נמדדה מקו הבסיס ועד לשיא השלילי המרבי. מדידות שיא המתח נורמלו למשרעת ה-CMAP המקסימלית שהתקבלה עבור כל שריר בניסוי. מדד סלקטיביות (SI) חושב עבור כל אתר פעיל כיחס בין משרעת ה-CMAP המנורמלת עבור שריר אחד, CMAP_i, וסכום אמפליטודות ה-CMAP המנורמלות בשלושת השרירים, לפי הנוסחה SI_i = nCMAP_i/∑nCMAP_j, במשרעת זרם הגירוי המינימלית שגררה תגובה שרירית רלוונטית פונקציונלית מינימלית (מוגדרת כ-5% משרעת CMAP לפחות עבור אחד השרירים ביחס למשרעת ה-CMAP המקסימלית של אותו שריר שנקבעה קודם לכן). לאחר מכן, האתרים הפעילים עם ה-SI הגבוה ביותר עבור כל אחד משלושת השרירים נבחרו כ-SIs עבור כל שריר בניסוי נתון.

תאימות ביולוגית תוך עצבית כרונית

בעקבות נוהל שדווח בעבר^50,63, העצב הסיאטי של חולדות נקבות Sprague-Dawley מורדמות (250-300 g, ∼בן 18 שבועות) נחשף והמכשירים לתאימות ביולוגית in vivo עם ובלי EGNITE הושתלו לאורך בענף השוקה של העצב הסיאטי (n = 6–8 לקבוצה). בקצרה, העצב מנוקב בשיבוש באמצעות מחט ישרה המחוברת לחוט לולאה 10-0 (STC-6, Ethicon); החוט מושך את הקצה בצורת חץ של רצועת האלקטרודה הכפופה. הקצה נחתך כדי להסיר את החוט, וקצות כל זרוע כפופים מעט כדי למנוע משיכה של המכשיר. שתל אורכי נבחר מכיוון שהוא מאפשר לימוד טוב יותר של תגובת הגוף הזר בתוך העצב⁵⁰.

הערכת תפקוד עצבים ובעלי חיים

בעלי חיים הוערכו במהלך מעקב לאחר ההשתלה באמצעות הולכה עצבית, אלגסימטריה ובדיקות תנועה של מסלול הליכה⁶². עבור בדיקות הולכה, העצב הסיאטי של הכפות המושתלות והקונטרלטרליות גורה על ידי אלקטרודות מחט במחריץ הסיאטי וה-CMAP של שריר ה-PL תועד כאמור לעיל. זמן ההשהיה והמשרעת של ה-CMAP נמדדו. עבור מבחן האלגסימטריה, חולדות הונחו על פלטפורמת רשת תיל והופעל גירוי מכני לא מזיק עם קצה מתכת המחובר ל-Von Frey אלגסימטר אלקטרוני (Bioseb). נמדד הסף הנוציספטיבי (כוח בגרמים שבו החיות משכו את הכפה) של כפות מושתלות לעומת כפות קונטרלטרליות. עבור מבחן מסלול ההליכה, פני השטח של הכפות האחוריות נצבעו בדיו שחורה וכל חולדה הושארה ללכת לאורך מסדרון. טביעות הרגל נאספו, והמדד התפקודי הסיאטי חושב⁶².

היסטולוגיה

לאחר שבועיים או 2 שבועות, בעלי חיים עברו זילוף ב-PFA (8%), והעצבים הסיאטיים נקצרו, קובעו לאחר מכן, נשמרו בהקפאה ועובדו לניתוח היסטולוגי. לצורך הערכת ה-FBR, עצבים סכיאטיים נחתכו בחתכים רוחביים בעובי 4 מיקרומטר עם קריוסטט (Leica CM15). דגימות נצבעו בנוגדנים ראשוניים לאקסונים בעלי מיאלין (אנטי-RT190 לסימון Neurofilament 97K, 200:1; Developmental Studies Hybridoma Bank) ומקרופאגים (anti-Iba-200, 1:1; Wako). לאחר מכן, קטעים הודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם נוגדנים משניים לחמור נגד עכבר Alexa Fluor 500 וחמור נגד ארנב Alexa Fluor 1 (488:555, Invitrogen). נבחרו קטעים מייצגים מהחלק המרכזי של השתל בעצב השוקה, תמונות שצולמו במיקרוסקופ אפיפלורסצנטי (Eclipse Ni, Nikon) המחובר למצלמה דיגיטלית (DS-Ri1, Nikon) וניתוח תמונה בוצע באמצעות תוכנת ImageJ (המכונים הלאומיים). של בריאות). כמות התאים החיוביים ל-Iba-200 בכל אזור העצב הטיביאלי נמדדה ועובי קפסולת הרקמה נמדד כמרחק הממוצע של כל צד של השתל לאקסונים הקרובים ביותר.

ניתוח סטטיסטי

לניתוח סטטיסטי של נתונים, השתמשנו ב-ANOVA חד או דו-כיווני ואחריו מבחן Bonferroni post-hoc עבור הבדלים בין קבוצות או זמנים. תוכנת GraphPad Prism שימשה לייצוג וניתוח גרפי. מובהקות סטטיסטית נחשבה מתי P <0.05.

סיכום הדיווח

מידע נוסף על עיצוב המחקר זמין ב סיכום דיווח תיקי טבע מקושר למאמר זה.

• הפצת תוכן ויחסי ציבור מופעל על ידי SEO. קבל הגברה היום.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. העצים את עצמך. גישה כאן.
• PlatoAiStream. Web3 Intelligence. הידע מוגבר. גישה כאן.
• PlatoESG. פחמן, קלינטק, אנרגיה, סביבה, שמש, ניהול פסולת. גישה כאן.
• PlatoHealth. מודיעין ביוטכנולוגיה וניסויים קליניים. גישה כאן.
• מקור: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01570-5