Vírusok és vírusváltozatok egyidejű azonosítása programozható DNS-nanocsalival

Betegmintagyűjtés

A betegek torkának (oropharyngealis tampon) letörlésével vett mintákat vettünk a korábban leírtak szerint.²⁶. A mintákat COVID-19-szerű klinikai képpel rendelkező betegektől gyűjtöttük, és nukleinsav-extrakció után qRT-PCR-rel teszteltük. Röviden, az összegyűjtés után a tamponokat egy lízispuffert (4 M guanidin-tiocianátot, 25 mM Tris-HCl-t, 0.5% β-merkaptoetanolt és MS2 RNS-t (200 ng µl) tartalmazó MSXNUMX RNS-t tartalmazó mintacsőbe helyeztük.^-1; Roche)). A csövet finoman megráztuk, hogy biztosítsuk a lízispuffer egyenletes eloszlását. A biztonsági lépéseket korábban leírták, és egy tanúsított CL2 laboratóriumban végezték el²⁶.

Nukleinsav extrakció

A teljes nukleinsavat spin-oszlop alapú rendszerekkel és standardizált qRT-PCR teszttel extraháltuk.²⁶. A belső erősítésvezérlő (MS2 (~6 × 10⁴ PFU ml^-110 ml lízispufferenként) hozzáadtuk a feltöltött lízispufferhez (25 µl/10 ml lízispuffer). A mintát 100 µl nukleázmentes vízben eluáltuk (nfH₂O; Invitrogen) és 1 percig állni hagyjuk, majd 1 percig 21,130 XNUMX×-on centrifugáljuk.g (15,000 80 ford./perc) asztali mikrofugában. Az eluált mintákat közvetlenül qRT-PCR-nek vetettük alá. A fennmaradó nukleinsav-kivonatokat –XNUMX °C-on tároltuk, és a továbbiakban nanobait–nanopórus érzékelésre használtuk.

qRT-PCR a SARS-CoV-2-hez

A SARS-CoV-2 kimutatását a korábban leírtak szerint végeztük²⁶. Reakciónként a mesterkeverék 12.5 µl 2× Luna Universal Probe One-Step reakciókeveréket, 0.5 µl 20 µM Wu forward primert (5′-ATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGA-3′), 0.5 µl 20 uM reverse primert tartalmazott. -GCAGTTGTGGCATCTCCTGATGAG-5'), 3 µl 0.3 µM MGB Probe 10 fluoreszcein (3'-ATGCTTAGAATTATGGCCTCAC-5'), 3 µl 0.5 µM belső kontroll 10M belső kontroll RNS-ből 2, 0.5 MS10 forward primer, 2. primer for MS0.3 RNS, 10 µl 2 µM belső próba (MS1 ROX), 3.9 µl Luna WarmStart RT Enzyme Mix és XNUMX µl nfH₂O. Ezután a mesterkeverékből 20 µl-t aliquot részekre osztunk egy 96 lyukú lemez minden egyes üregébe, majd egyesítjük az egyes kivonatokból 5 µl-rel. A teljes extrakciós protokollon átesett MS2 belső extrakciós és amplifikációs kontroll negatív extrakciós kontrollként szerepelt a qRT-PCR lemez legalább két üregében. A lehetséges szennyeződés meghatározásához a qRT-PCR folyamatban 5 µl nfH₂Az O-t qRT-PCR negatív kontrollként alkalmaztuk. Ezután 5 µl tüskés SARS-CoV-2 templát plazmidot helyeztünk egyetlen lyukba, mint a qRT-PCR pozitív kontrollt. Miután minden mintából 5 µl-t adtunk a kijelölt lyukhoz, a lemezt optikailag átlátszó műanyag tömítéssel lezártuk. A lemezt 1 percig 2,000-szeres sebességgel centrifugáltukg (1,000 ford./perc) 4 °C-on, majd behelyezzük a qRT-PCR gépbe (QuantStudio, Thermo Fisher Scientific), és a futtatást paraméterezzük. A fluoreszcein (FAM) és a karboxirodamin (ROX) jeleit megszereztük. A belső MS2 kontroll kimutatására ROX-ot, a SARS-CoV-2 RNS kimutatására fluoreszceint használtunk. A vizsgálatot 2 percig 25 °C-on, 15 percig 50 °C-on (a reverz transzkriptázhoz), 2 percig 90 °C-on végeztük, 45 ciklus előtt 95 °C-on 3 másodpercig, majd 60 °C-on 30 másodpercig. . Az eredményeket a helyes pozitív kontrollok megerősítése (a plazmid amplifikációja), az összes minta extrakciója és amplifikációs kontrollja (ROX csatorna), a negatív kontrollok nem amplifikációja és a kontrollok konzisztens átlagértékei határozták meg. A SARS-CoV-2 pozitivitást a fluoreszcein csatornában végzett amplifikáció igazolta megfelelő szigmoid görbével ≤36 CT érték mellett. Az MS2 és az MGB 3. szonda CT-értékeit megőriztük a vizsgálat minőségének és reprodukálhatóságának nyomon követése érdekében⁴⁴.

Programozható RNase H vágás nanocsalihoz

A nanopórusérzékeléshez SARS-CoV-2 RNS kontrollokat, nukleinsav-kivonatokat (betegminták) vagy MS2 vírus RNS-t használtunk a nanocsalival történő kimutatáshoz. Először vezető oligot kevertünk a mintához, és 70 percig 5 °C-ra melegítettük. RNáz H-t (5,000 egység/ml; NEB) adtunk hozzá, összekevertük és 20 percig 37 °C-on melegítettük, hogy az enzim levágja az RNS-t a DNS-ben: RNS hibrid, amely hatékonyan felszabadítja a cél RNS-t. Az RNáz H-t termikusan inaktiváltuk 65 °C-on 10 percig tartó inkubálással. A vezető oligokat a NUPACK szoftverrel validáltuk, hogy nem képeznek intramolekuláris struktúrákat, homo- vagy heterodimereket⁴⁵. A hiányzó célponttal végzett méréshez ugyanazt a protokollt használtuk, beleértve a vezető oligokat. A kontroll mérések nem mutatnak elmozdulást, így kizárhatunk bármilyen lényeges keresztkötést a vezető oligókból.

Vírusos célszekvencia tulajdonságai nanocsalihoz

A cél hosszát, a lábujj hosszát és a GC-tartalmat úgy választottuk meg, hogy biztosítsuk az optimális hibridizációt²¹. A DNS nanobait tervekhez a célszekvenciákat úgy választottuk ki, hogy a vírusgenom konzervált régióiban legyenek, és 40-60% GC tartalommal rendelkezzenek, hogy stabil 20 bp duplexet hozzanak létre. A lábujjtartó hosszát 6 nt hosszúra és 40-60% GC-tartalomra választottuk. Az összes szekvenciát teszteltük a potenciális nemkívánatos, rendkívül stabil intramolekuláris kölcsönhatások vagy homodimerek szempontjából a NUPACK szoftverrel (web alkalmazás 2020)⁴⁵. Ezután keresztreaktivitás-ellenőrzést végeztünk az egyes kísérletekben alkalmazott több hely között⁴⁵.

DNS virág előkészítése nanocsalihoz

A SARS-CoV-2 RNS kimutatására a betegmintákból DNS-virágot terveztünk. Három, minden SARS-CoV-2 célpontra specifikus DNS-virágot (hétirányú csomópontok, 7WJa, 7WJb és 7WJc) külön-külön készítettünk. Példaként 7WJc, 4 μM DNS szál J1, J2, J3 és J4c (kiegészítő táblázat 1) összekevertük TM pufferben (10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, pH 8.0) és 90 °C-ra melegítjük 5 percig, majd lehűtjük 65 °C-ra 15 percre, 45 °C-ra 15 percre, 37 °C-ra 20 percre, 25 °C-ra 20 percre, végül 4 °C-ra. C-on 20 percig. A J4c szálat J4b-vel helyettesítettük a 7WJb előállítására. A 7WJa esetében, hogy elkerüljük a nanocsali 43. helyén az önhajtást, a J1, J2, J3 J4a és C43 összekevertük a lágyítás előtt.

DNS nanocsali önösszeállítása

A DNS nanocsalit úgy állították össze, hogy linearizált egyszálú M13 DNS-t (M13mp18, 7,249 nt, Guild Biosciences, 100 nM) rövid, komplementer oligonukleotidokkal összekevertünk.¹² (amelyek némelyike ​​referenciastruktúrákat és befogó szálakat tartalmazott), valamint részlegesen komplementer szálak hozzáadásával, amelyek 3'-biotinileztek a toehold által közvetített száleltolódási reakcióhoz. A linearizált M13 DNS-t (7,228 nt hosszúságú) oligonukleotidokkal egészítettük ki, ezáltal egy bevágott, kétszálú nanocsalit hoztunk létre, két-terminális négy dezoxitimidin túlnyúlással, amelyek megakadályozzák a multimerizációt.¹². A keverék 20 nM linearizált M13 DNS-t, 60 nM oligonukleotidot (az M13 DNS-hez képest háromszoros feleslegben), 3'-biotinilált szálakat tartalmazott 180 nM koncentrációban, 10 mM MgCl-t.₂ és 1×TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0). Pipettázással összekeverjük, majd lecentrifugáljuk, majd 70 másodpercig 30 °C-ra melegítjük, majd 45 perc alatt lehűtjük környezeti hőmérsékletre. A felesleges oligonukleotidokat Amicon Ultra 0.5 ml-es centrifugális szűrőkkel távolítottuk el 100 kDa vágási határértékkel mosópufferrel (10.0 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM MgCl).₂). Ha DNS-virágokat használtunk jelölésként, az azt hordozó, részben komplementer szálakat 10 mM MgCl-ben inkubáltuk.₂ 2 órán át szobahőmérsékleten, majd az Amicon szűrést a fent leírtak szerint végeztük. A nanobait kialakítás aszimmetriája lehetővé teszi a kötőhelyek egyértelmű azonosítását. A nanocsalit a további kísérletekhez való felhasználásig 4-10 °C-on tároltuk 0.5 mM MgCl-ben.₂10.0 mM Tris-HCl, pH 8.0. A nanocsali tervezését minden mérés előtt nanopórus leolvasással ellenőriztük.

A DNS nanocsali nanopórus-leolvasása

A nanocsalit egy mintával (nukleinsav-kivonat vagy tisztított víruscélpontok tízszeres feleslegben) kevertük 10 mM MgCl-ben.₂ és 100 mM NaCl. A keveréket (5 μl) szobahőmérsékleten (~10 perc) inkubáltuk a nanopórusméréshez. A célszekvencia összetételének és fizikai jellemzőinek különbsége a hibridizáció változékonyságához vezethet, és ezáltal az érzékelő helyek eltolási hatékonyságához.²¹. htRNS-t használtunk (100 ng μl^-1; Invitrogen) háttérként, ahol jeleztük, annak bizonyítására, hogy nincsenek a humán natív RNS-ek által indukált nem specifikus jelek. A nanopórusméréshez a mintát <0.5 nM nanobaitre hígítottuk (tisztított víruscélpontok esetén), vagy 4.7 μl RNáz-H-vágott betegmintát kevertünk össze 0.3 µl monovalens sztreptavidinnel (SAe1D3).¹⁸ (1 μM), 5 μl LiCl (4.0 M) és 5.0 μl LiCl (8.0 M). 14 ± 3 nm-es (átlag ± standard deviáció) nanopórusokat állítottunk elő¹² 0.5 mm külső átmérőjű és 0.2 mm belső átmérőjű kvarcüveg kapillárisok (Sutter Instrument) felhasználásával lézerrel segített P-2000 lehúzóval (Sutter Instrument). A keveréket nanopórusos polidimetilsziloxán chipbe pipettáztuk, és minden mérést állandó 600 mV feszültség mellett végeztünk. A nanopórus mérés részletei a kiegészítő táblázatban láthatók 30.

Valós idejű nanopórus adatok elemzése

A nanopórus adatok elemzését a Kiegészítő részben ismertetjük részletesen 14. Röviden, a nanobait eseményeket kiszűrtük a nyers ionáram nyomaiból, majd meghatároztuk a detektálási régiót, és kinyertük a tüske jelenlétéről szóló információkat az egyes helyeken. Az ábrázolt eltolási hatékonyságot úgy számítottuk ki, mint egy mérés elmozdulási hatékonyságát, amelyből levontuk a cél nélküli kontrollt minden egyes helynél (50 nanobait esemény mindhárom nanopórusos felvételnél), hacsak nincs másképp jelezve:

Ellenőriztük, hogy a konvolúciós neurális hálózat QuipuNet²⁷ képes volt a nanopórus adatok valós idejű elemzésére a leírt eljárást követve. Korábban bemutattuk, hogy körülbelül tíz eseménnyel elérjük a 99%-os megbízhatóságot a tervezett DNS-struktúráink pozitív kimutatásában.⁴⁶.

AFM képalkotás

A nanocsalik AFM (Nanosurf Mobile S) leképezését levegőben, érintésmentes módban végeztük. A nanobait szerkezeteket 1 ng μl-re hígítottuk^-1 1 mM MgCl-ban₂ és 10 μl-t adtunk a frissen hasított csillámhoz, 1 percig inkubáltuk, szűrt Milli-Q vízzel öblítettük, majd nitrogénnel szárítottuk. A szkennelés előtt a csillámlemezt kétoldalas ragasztószalaggal az AFM mintaasztalhoz rögzítették. A képvizualizációt és -elemzést a Gwyddion (2.60-as verzió) segítségével végeztük.

Statisztikai analízis

Az összes méréshez 99.9%-os konfidenciaintervallumot számítottunk az eltolási hatékonyságra. A statisztikai szignifikanciát két célpont nélküli és célponttal rendelkező hely között kétoldalas Student-féle módszerrel teszteltük t-teszt.

Jelentési összefoglaló

A kutatástervezésről további információk a Nature Portfolio Reporting Összefoglaló ehhez a cikkhez kapcsolódik.

• SEO által támogatott tartalom és PR terjesztés. Erősödjön még ma.
• Platoblockchain. Web3 metaverzum intelligencia. Felerősített tudás. Hozzáférés itt.
• Forrás: https://www.nature.com/articles/s41565-022-01287-x