Animaux
Les expériences ont été menées conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Les protocoles ont été approuvés par le Comité local d'éthique animale (Comité Charles Darwin n° 5, n° d'enregistrement 9529 et 26889) et menés en accord avec la directive 2010/63/UE du Parlement européen. Des rats mâles Long–Evans âgés de 2 à 12 mois et des souris mâles WT (C57BL/6J) âgées de 9 semaines ont été obtenus auprès des Laboratoires Janvier ; Des rats transgéniques mâles P23H (lignée 1) (9–22 mois) ont été élevés localement.
Clonage plasmidique et production d'AAV
Plasmides contenant le E. coli mscL séquence sous la forme WT et avec la mutation G22S ont été obtenues auprès de Francesco Difato (plasmides Addgene #107454 et #107455)28. Pour cibler les RGC, le promoteur SNCG31 a été inséré dans un plasmide squelette AAV contenant le mscl séquence fusionnée au gène tdTomato et au signal d'exportation Kir2.1 ER, pour piloter l'expression au niveau de la membrane plasmique. Un vecteur AAV2.7m8 a été utilisé pour l'administration intravitréenne. Pour cibler les neurones des couches corticales V1, le promoteur SNCG a été remplacé par le promoteur CamKII et un vecteur AAV9.7m8 a été choisi. Des AAV recombinants ont été produits par la méthode de co-transfection plasmidique et les lysats résultants ont été purifiés par purification à l'iodixanol31.
Stimulation américaine
Trois transducteurs US focalisés avec des fréquences centrales différentes ont été utilisés : 0.50 MHz (diamètre, Ø = 1.00″ = 25.4mm; distance focale, f = 1.25″ = 31.7 mm) (V301-SU, Olympe), 2.25 MHz (Ø = 0.50″ = 12.7mm, f = 1.00″ = 25.4 mm) (V306-SU, Olympus) et 15.00 MHz (Ø = 0.50″ = 12.7mm, f = 1.00″ = 25.4 mm) (V319-SU, Olympus), correspondant aux ouvertures numériques de F/Ø = 1.25 et 2.00. Les champs acoustiques rayonnés par ces trois transducteurs focalisés sont présentés sur la Fig. 1 (simulations) et Extended Data Fig. 3 (mesures expérimentales). Un TiePie Handyscope (HS5, TiePie Engineering) a été utilisé pour produire la forme d'onde de stimulation, qui a ensuite été transmise à un amplificateur de puissance RF de 80 dB (VBA 230-80, Vectawave) connecté au transducteur. Les sorties de pression du transducteur (pression au foyer, cartes de pression tridimensionnelles (3D)) ont été mesurées dans un réservoir d'eau dégazée avec un interféromètre hétérodyne Royer-Dieulesaint47. Les stimuli américains utilisés pour la stimulation ex vivo et in vivo avaient les caractéristiques suivantes : fréquence de répétition des impulsions de 1 kHz avec un rapport cyclique de 50 %, durée de sonication entre 10 et 200 ms et intervalle interstimulus entre 0.01 et 2.00 s. Les pressions acoustiques maximales variaient de 0.11 à 0.88 MPa, 0.30 à 1.60 MPa et 0.20 à 1.27 MPa pour les transducteurs 0.50, 2.25 et 15.00 MHz, respectivement. Les valeurs d'intensité moyenne d'impulsion spatiale maximale estimée correspondantes (Isppa) étaient de 0.39 à 25.14, de 2.92 à 83.12 et de 1.30 à 52.37 W cm-2.
Livraison intravitréenne de gènes et imagerie rétinienne
Les rats ont été anesthésiés48 et suspension d'AAV (2 µl), contenant entre 8 et 14 × 1010 particules virales, a été injecté au centre de la cavité vitréenne. Un mois plus tard, une imagerie de fluorescence tdTomato a été réalisée sur les yeux injectés, avec un microscope d'imagerie rétinienne MICRON IV (Phoenix Research Laboratories) et Micron Discover v.2.2.
Enregistrements MEA
Les morceaux de rétine ont été aplatis sur une membrane filtrante (Whatman, GE Healthcare Life Sciences) et placés sur un MEA (diamètre d'électrode, 30 µm ; espacement, 200 µm ; MEA256 200/30 iR-ITO, MultiChannel Systems) recouvert de poly-l-lysine (0.1 %, Sigma), avec les CGR face aux électrodes31. Antagoniste des récepteurs AMPA/kainate glutamate 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX, 25 μM, Sigma-Aldrich), l'antagoniste des récepteurs NMDA glutamate [3H]3-(2-carboxypipérazin-4-yl) propyle l'acide -1-phosphonique (CPP, 10 μM, Sigma-Aldrich) et un agoniste sélectif des récepteurs métabotropiques du groupe III au glutamate, lL'acide -(+)-2-amino-4-phosphonobutyrique (LAP4, 50 μM, Tocris Bioscience) a été appliqué dans un bain via la ligne de perfusion. Les stimuli lumineux ont été délivrés avec un écran numérique à micromiroir (Vialux; résolution, 1,024 768 × 4) couplé à une source de lumière à diode électroluminescente blanche (MNWHL1, Thorlabs) focalisée sur le plan du photorécepteur (irradiance, XNUMX µW cm-2). Les transducteurs US ont été couplés à un cône de couplage sur mesure rempli d'eau dégazée et monté sur une platine motorisée (PT3/M-Z8, Thorlabs) placée orthogonalement au-dessus de la rétine. Le signal réfléchi de la puce MEA et de la rétine a été détecté avec un dispositif à clé US (Lecoeur Electronique). La distance entre la rétine et le transducteur était égale à la distance focale du transducteur ; ceci a été vérifié avec le temps de vol du signal réfléchi. À partir d'enregistrements RGC avec un préamplificateur 252 canaux et MC_Rack v. 4.6.2 (systèmes multicanaux), les pointes ont été triées avec le logiciel Spyking CIRCUS 0.549. Les réponses RGC ont été analysées avec des scripts personnalisés écrits dans MATLAB (MathWorks 2018b) pour la classification comme ON, ON–OFF ou OFF, avec l'indice de dominance de réponse50. Les latences ont été calculées comme le temps entre le début du stimulus et le maximum de la dérivée de la fonction de densité de pointe (SDF). Deux classes de cellules répondant à l'US ont été identifiées sur la base de la latence - SL et LL - en fixant un seuil égal au minimum de la distribution de latence des réponses des cellules NT à l'US (45 ms). Nous avons déterminé la valeur maximale A du SDF pour le calcul de la durée de réponse, qui a été définie comme l'intervalle de temps entre les deux points temporels pour lesquels le SDF était égal à A/e (OÙ A est la dépolarisation maximale et e est le nombre d'Euler). Le facteur Fano, quantifiant la variabilité du nombre de pointes, a été calculé comme le rapport de la variance du nombre de pointes à la moyenne. La distance euclidienne entre deux cellules activées a été pondérée en fonction de la cadence de tir maximale des cellules. Le rapport du nombre de cellules activées à la taille de la zone stimulée sur la puce MEA a été calculé en considérant la taille de la tache focale US pour 2.25 et 15.00 MHz et la taille de la MEA pour 0.50 MHz, car la tache focale était plus grande que le MEA pour cette fréquence. Le centre de la réponse a été estimé en pondérant le taux de déclenchement maximal de chaque cellule par sa distance par rapport aux autres cellules répondantes, et le déplacement de la réponse a été calculé comme la distance euclidienne entre deux positions du centre de réponse.
Injections intracrâniennes
Des suspensions d'AAV ont été injectées dans l'hémisphère droit à deux endroits différents chez le rat (2.6 mm ML, 6.8 mm AP et 3.1 mm ML, 7.2 mm AP du bregma) ou à un endroit chez la souris (2.5 mm ML, 3.5 mm AP du bregma)48. Pour les injections chez le rat, la suspension (200 nl contenant 0.2–8.0 × 1015 particules virales) a été injecté à trois profondeurs différentes (1,100 1,350, 1,500 4 et 50 XNUMX µm de la surface corticale) avec un contrôleur de pompe à microseringue (MicroXNUMX, World Precision Instruments) fonctionnant à un débit de XNUMX nl min-1 et 10 µl de seringue Hamilton. Chez la souris, la suspension d'AAV (1 µl contenant 0.2–8.0 × 1015 particules virales) a été injecté à 400 µm de la surface corticale à un débit de 100 nl min-1.
Enregistrements extracellulaires in vivo
Un mois après les injections d'AAV, une petite craniotomie (5 × 5 mm2) a été réalisée au-dessus de V1 dans l'hémisphère droit48. La fluorescence de tdTomato a été vérifiée avec un microscope d'imagerie rétinienne MICRON IV et Micron Discover v. 2.2 (Phoenix Research Laboratories). Un réseau d'électrodes µEcog de 32 sites (diamètre des électrodes, 30 µm ; espacement des électrodes, 300 µm ; FlexMEA36, MultiChannel Systems) a été positionné sur la région transfectée ou dans une zone similaire pour les rats témoins. Les enregistrements MEA ont été effectués avec une microsonde en silicium à 16 sites inclinée à 45° par rapport à la surface du cerveau (diamètre des électrodes, 30 µm ; espacement, 50 µm ; A1x16-5mm-50-703, NeuroNexus Technologies) et MC_Rack v. 4.6.2. Le MEA a été avancé de 1,100 4 µm dans le cortex avec un micromanipulateur à trois axes (Sutter Instruments). Des transducteurs US ont été couplés au cerveau avec un cône de couplage sur mesure rempli d'eau dégazée et de gel US sur une platine motorisée. La distance entre le cortex et le transducteur était égale à la distance focale du transducteur. Les stimuli visuels ont été générés par une diode électroluminescente collimatée en lumière blanche (MNWHL15, Thorlabs) placée à 4.5 cm de l'œil (XNUMX mW cm-2 à la cornée). Les enregistrements ont été numérisés avec des amplificateurs 32 canaux et 16 canaux (modèle ME32/16-FAI-μPA, MultiChannel Systems). Les enregistrements µEcog ont été analysés avec des scripts MATLAB développés sur mesure et les enregistrements MEA ont été analysés avec le logiciel Spyking CIRCUS et des scripts MATLAB développés sur mesure. La durée de réponse a été calculée comme l'intervalle entre les deux points temporels auxquels le potentiel évoqué cortical était égal à A/e. La zone activée a été définie comme la zone de la carte d'activation des pseudo-couleurs sur laquelle la dépolarisation maximale dépassait le niveau de bruit de fond calculé comme 2 × sd du signal. Le centre de réponse a été estimé en pondérant le pic de dépolarisation de chaque électrode par sa distance par rapport aux autres électrodes. Son déplacement relatif lors du déplacement du transducteur américain a été calculé comme la distance euclidienne des deux positions. Pour les enregistrements intracorticaux, la latence cellulaire a été estimée comme le temps entre le début du stimulus et le maximum de la dérivée de SDF.
Chirurgie pour les tests comportementaux in vivo
Des souris C57BL6J ont reçu une injection sous-cutanée de buprénorphine (0.05 mg kg-1) (Buprécare, Axience), et la dexaméthasone (0.7 mg kg-1) (Dexazone, Virbac). Les animaux ont été anesthésiés à l'isoflurane (5% d'induction et 2% d'entretien, dans un mélange air/oxygène) et la tête a été rasée et nettoyée avec une solution antiseptique. La tête des animaux a été fixée sur un cadre stéréotaxique avec un système de distribution d'isoflurane et une pommade oculaire, et un tissu noir a été appliqué sur les yeux. La température corporelle était maintenue à 37 °C. Après une injection locale de lidocaïne (4 mg kg-1) (Laocaïne, Centravet), une incision a été pratiquée sur la peau. Deux vis ont été fixées dans le crâne, après une petite craniotomie (environ 5.0 × 5.0 mm2) a été réalisée au-dessus de V1 dans l'hémisphère droit (foret en acier de 0.5 mm) et un tampon cortical a été appliqué. Le cortex a été recouvert d'une feuille de plastique TPX (125 µm d'épaisseur) et scellé avec du ciment acrylique dentaire (Tetric Evoflow). Pour les expériences comportementales, une barre de tête métallique (PhenoSys) pour la fixation de la tête a ensuite été collée au crâne sur l'hémisphère gauche avec du ciment dentaire (FujiCEM 2). Les animaux ont été placés dans une chambre de récupération, avec une injection sous-cutanée de sérum physiologique et de pommade sur les yeux (Ophtalon, Centravet). La buprénorphine a été injectée lors du suivi postopératoire.
Tests comportementaux de la souris
Les souris ont été soumises à un programme de restriction hydrique jusqu'à ce qu'elles atteignent environ 80 à 85 % de leur poids. Suite à l'accoutumance aux conditions d'essai36, des souris ont été entraînées à répondre à un LS en effectuant une tâche de détection volontaire : lécher une trombe marine (aiguille émoussée de calibre 18, à environ 5 mm de la bouche) en réponse à une stimulation plein champ en lumière blanche (200 et 50 ms de long) de l'œil gauche (dilaté au tropicamide, Mydriaticum Dispersa) sur 35 essais par durée de stimulation et donc 70 essais par jour. De l'eau (~ 4 μl) a été automatiquement distribuée 500 ms après l'allumage de la lumière, via un système d'eau calibré. Le protocole comportemental et la détection du léchage ont été contrôlés par un système sur mesure36. Les quatre jours suivants (deux jours de pause pendant le week-end), des stimulations US ont été délivrées sur V1 pendant 50 ms à trois valeurs de pression différentes (0.2, 0.7 et 1.2 MPa). Ces valeurs de pression ont été délivrées dans un ordre différent chaque jour (35 essais chacune). Les intervalles entre les essais variaient au hasard et variaient entre 10 et 30 s. Le transducteur US de 15 MHz a été couplé au cerveau avec un cône de couplage sur mesure rempli d'eau et de gel US. Le taux de réussite a été calculé en comptant le nombre d'essais au cours desquels les souris ont effectué des léchages d'anticipation (entre le début du stimulus et l'ouverture de la vanne d'eau). Le taux de léchage anticipé (Fig. 6e) pour la session a été calculé en soustrayant du taux de léchage anticipé d'un essai, le taux de léchage spontané (calculé sur toutes les fenêtres de temps de 1 s avant le début de chaque stimulus individuel (Fig. 6a) pour tous les essais) et multiplication par le taux de réussite. La latence du léchage a été calculée en déterminant le temps jusqu'au premier léchage anticipé après le début du stimulus. Les souris retenues pour analyse ont présenté un taux de réussite supérieur ou égal à 60% au quatrième jour suivant LS. Ensuite, les sessions légères ou US montrant un comportement de léchage compulsif ont été exclues sur la base de l'identification des valeurs aberrantes faite à l'aide de la méthode ROUT (Q = 1%) sur le taux de léchage spontané de la session en faisant la moyenne des mesures sur tous les essais de la session dans la fenêtre de temps de 1 s avant le début du stimulus de l'essai.
Immunohistochimie et imagerie confocale
Les échantillons ont été incubés pendant une nuit à 4 ° C avec un anticorps monoclonal anti-RBPMS (1: 500, lapin; ABN1362, Merck Millipore) pour la rétine31, avec un anticorps monoclonal anti-NeuN (1:500, souris, clone A60 ; MAB377, Merck Millipore) pour les coupes de cerveau48. Les coupes ont ensuite été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à Alexa Fluor 488 (1:500, âne anti-souris et âne anti-lapin IgG 488, polyclonal ; A-21202 et A-21206, Invitrogen, respectivement) et DAPI (1:1,000 9542 ; D1, Merck Millipore) pendant 1000 h à température ambiante. Un microscope confocal Olympus FV20 avec objectif ×20 (UPLSAPO 0.85XO avec une ouverture numérique de 10) a été utilisé pour acquérir les images de rétines montées à plat et de sections de cerveau (logiciel FV4.2-ASW v. XNUMX).
Sur les images confocales traitées avec Fidji (ImageJ v. 1.53q), les cellules RBPMS- et NeuN-positives ont été automatiquement comptées avec le plugin « analyser les particules ». Les cellules ont été comptées manuellement par deux utilisateurs différents, avec le plugin 'cell counter'. La quantification a été réalisée en acquérant des piles confocales dans au moins quatre régions transfectées choisies au hasard de 0.4 mm2 (Données étendues Fig. 1). Pour les neurones V1, la tranche de cerveau sagittale avec la plus grande zone de fluorescence tdTomato a été sélectionnée pour chaque animal. Une région d'intérêt a été définie manuellement en V1 et les quantifications ont été effectuées dans au moins six régions choisies au hasard de 0.4 mm2.
Simulations de chauffage des tissus induites par les États-Unis
Un triple processus a été utilisé pour l'estimation des effets thermiques : (1) simulation des champs acoustiques générés par les trois transducteurs, avec des paramètres acoustiques réalistes ; (2) vérification que l'acoustique non linéaire ne jouait pas un rôle important dans le transfert de chaleur ; et (3) des simulations réalistes du transfert de chaleur et de l'élévation de température induits au foyer par les États-Unis dans un régime linéaire pour les paramètres utilisés dans cette étude.
Pour les simulations non linéaires, nous avons utilisé la boîte à outils k-Wave de MATLAB en définissant la géométrie du transducteur en trois dimensions et en utilisant les paramètres suivants pour le milieu de propagation (eau) : vitesse du son, c = 1,500 XNUMX ms-1; masse volumétrique, ρ = 1,000 XNUMX kg·m-3; coefficient de non linéarité, B/A = 5 ; coefficient d'atténuation, α = 2.2 × 10-3 dBcm-1 MHz-y; loi fréquence puissance du coefficient d'atténuation, y = 2 (réf. 51). Nous avons simulé des champs d'ondes 3D quasi-monochromatiques en utilisant de longues rafales de 50 cycles ; cela nous a donné le champ de pression maximum en trois dimensions ainsi que la forme d'onde au foyer. Les simulations ont été calibrées en ajustant la pression d'entrée (excitation du transducteur simulé) pour atteindre la pression au foyer mesurée dans le réservoir d'eau avec de vrais transducteurs. Le diamètre de la tache focale pleine largeur à mi-hauteur (FWHM) dans le x-y plan était de 4.360, 1.610 et 0.276 mm, et la longueur du grand axe dans le x-z était de 32.3, 20.6 et 3.75 mm pour les transducteurs 0.50, 2.25 et 15.00 MHz, respectivement (Fig. 1b-d). Les effets non linéaires ont été évalués en estimant le contenu harmonique relatif de la forme d'onde au foyer. Dans l'exemple de transducteur de focalisation de 15 MHz de la Fig. 1d, les signaux expérimentaux et simulés au point focal ont été comparés et se sont avérés hautement concordants (Extended Data Fig. 4a). De plus, l'amplitude de la deuxième harmonique est de 19.8 dB en dessous du fondamental (20.9 dB dans le cas simulé), ce qui signifie que si l'énergie fondamentale est E, la deuxième harmonique a une énergie E/95 (Données étendues Fig. 4b). Par conséquent, nous pouvons raisonnablement négliger les effets non linéaires dans les calculs des effets thermiques, car ils représentent environ 1 % de l'énergie impliquée. Les mêmes conclusions ont été tirées à 0.5 MHz et 15.0 MHz. Les approximations linéaires de propagation des ondes ont considérablement diminué le coût de calcul des simulations. Des simulations de propagation linéaire ont été réalisées avec la boîte à outils Field II dans MATLAB52,53, en mode monochromatique, avec les mêmes propriétés de milieu que k-Wave (eau), pour obtenir les champs de pression maximum 3D. Ces champs de pression maximum ont été utilisés pour construire un terme source de chaleur (Q_{mathrm{US}} = frac{{alpha _{mathrm{np}}p_{mathrm{max}}^2}}{{rho _mathrm{b}c_mathrm{b}}}), Où αnp est le coefficient d'absorption du cerveau à la fréquence considérée (59.04 Np m-1 à 15 MHz, calculé à partir de αcerveau = 0.21 dB·cm-1 MHz-y ainsi que y = 1.18), la masse volumétrique cérébrale ρcerveau = 1,046 XNUMX kg·m-3, la vitesse du son cérébral ccerveau = 154 s-1 ainsi que pmax est le champ de pression maximale 3D. Ce terme source a ensuite été utilisé dans la résolution d'une équation de biochaleur de Penne (rho _{mathrm{cerveau}}C_{mathrm{cerveau}}timesfrac{{partial T}}{{partial t}} = mathrm{div}left( {K_mathrm{t}timesnabla T} right) – rho _{ mathrm{sang}}C_{mathrm{sang}}P_{mathrm{sang}}gauche ({T - T_mathrm{a}} droite) + Q) en k-Wave, où Ccerveau est la capacité thermique spécifique du sang (3,630 XNUMX J kg-1 ° C-1), Kt est la conductivité thermique du cerveau (0.51 W m-1 ° C-1), ρsang est la densité sanguine (1,050 XNUMX kg m-3), Csang est la capacité thermique spécifique du sang (3,617 XNUMX J kg-1 ° C-1), Psang est le coefficient de perfusion sanguine (9.7 × 10-3 s-1), Ta est la température artérielle (37 °C), Q = QUS + ρcerveauγcerveau ainsi que γcerveau est la génération de chaleur du tissu cérébral (11.37 W kg-1) (réfs. 54,55). La condition initiale pour la température du cerveau a été fixée à T0 = 37 °C.
Cette simulation correspond au scénario le plus défavorable concernant l'élévation de température donnée. (1) La propagation acoustique est simulée dans l'eau seule (valeur non déclassée), avec un coefficient d'atténuation plus faible (2.2 × 10-3 dB·cm MHz-2.00) que le cerveau (0.59 dB cm MHz-1.27), même si une partie de la propagation se fait à l'intérieur du cerveau. Le pmax Les cartes sont donc surestimées. (2) L'absorption thermique est simulée dans le tissu cérébral uniquement, avec un coefficient d'absorption plus élevé (0.21 dB cm MHz-1.18) que l'eau, même si une partie du champ de pression maximale est en réalité située dans l'eau du cône de couplage acoustique. Donc, QUS est légèrement surestimé. Nous avons cartographié la température en trois dimensions spatiales et temporelles, et recherché le point d'augmentation maximale de la température (Extended Data Fig. 4c–f).
analyses statistiques
Les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel Prism (Prism 9, GraphPad). Les valeurs sont exprimées et représentées sous forme de valeurs moyennes ± erreur type de la moyenne (sem) sur les figures et dans le texte, sauf indication contraire. Les données ont été analysées dans des Welch non appariés t-tests (deux queues) ou un multiple non apparié t-test avec correction de Sidak–Bonferroni pour les comparaisons multiples. Des tests statistiques sont fournis dans les légendes des figures.
Résumé du rapport
De plus amples informations sur le design de la recherche sont disponibles dans Sommaire des rapports sur le portefeuille de la nature lié à cet article.
- Contenu propulsé par le référencement et distribution de relations publiques. Soyez amplifié aujourd'hui.
- Platoblockchain. Intelligence métaverse Web3. Connaissance Amplifiée. Accéder ici.
- La source: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01359-6
- :est
- ][p
- $UP
- 000
- 1
- 10
- 100
- 11
- 1996
- 2%
- 2017
- 2018
- 2020
- 2021
- 28
- 39
- 3d
- 7
- 70
- 8
- 9
- a
- au dessus de
- académique
- accédé
- Selon
- Compte
- acquérir
- acquisition
- Activation
- activité
- actually
- Avancée
- Après
- âgé
- contrat
- AL
- Alexa
- Tous
- permet
- selon une analyse de l’Université de Princeton
- Présentatrice
- ainsi que
- animal
- animaux
- Anticorps
- appliqué
- ,
- d'environ
- SONT
- Réservé
- tableau
- article
- AS
- Évaluation de risque climatique
- At
- Août
- automatiquement
- disponibles
- moyen
- moyenne
- Axis
- Colonne vertébrale
- basé
- base
- BE
- car
- before
- ci-dessous
- jusqu'à XNUMX fois
- Noir
- sang
- corps
- Cerveau
- Pause
- tampon
- construire
- by
- calculé
- CAN
- Compétences
- les soins
- maisons
- Cellules
- central
- centre
- Chambre
- Développement
- caractéristiques
- Charles
- puce
- choisi
- les classes
- classification
- cliquez
- comité
- par rapport
- complet
- informatique
- condition
- menée
- conductivité
- connecté
- considéré
- considérant
- contenu
- des bactéries
- contrôlée
- contrôleur
- Correspondant
- correspond
- Prix
- accouplé
- couvert
- Customiser
- cycle
- cycles
- données
- Base de données
- journée
- jours
- défini
- définir
- livré
- page de livraison.
- densité
- Profondeurs
- Conception
- détecté
- Détection
- déterminé
- détermination
- Développement
- dispositif
- DID
- différent
- numérique
- numérisés
- dimensions
- découvrez
- Commande
- distance
- distribution
- Dominance
- tiré
- motivation
- pendant
- e
- chacun
- les effets
- énergie
- ENGINEERING
- améliorée
- erreur
- estimé
- Ether (ETH)
- éthique
- du
- Parlement européen
- évalué
- Pourtant, la
- exemple
- excité
- exclu
- d'experience
- Exporter
- exprimé
- œil
- Yeux
- champ
- Des champs
- figues
- Figure
- Figures
- rempli
- une fonction filtre
- cuisson
- Prénom
- fixé
- vol
- Focus
- concentré
- Abonnement
- Pour
- formulaire
- trouvé
- Quatrièmement
- CADRE
- La fréquence
- De
- fonction
- fonctionnel
- fondamental
- En outre
- ge
- GE Healthcare
- généré
- génération
- géométrie
- donné
- Sol
- Réservation de groupe
- guide
- Hamilton
- front
- Santé
- la médecine
- augmentation
- très
- HTTPS
- humain
- i
- Identification
- identifié
- IEEE
- satellite
- Imagerie
- important
- in
- incubé
- individuel
- d'information
- initiale
- contribution
- instruments
- intérêt
- impliqué
- SES
- ACTIVITES
- laboratoire
- plus importantes
- le plus grand
- Latence
- Droit applicable et juridiction compétente
- poules pondeuses
- Legends
- Longueur
- Niveau
- léchage
- VIE
- Life Sciences
- lumière
- Gamme
- LINK
- lié
- locales
- localement
- situé
- emplacement
- emplacements
- Location
- regardé
- LES PLANTES
- facile
- majeur
- manuellement
- Localisation
- Map
- Masse
- Matériel
- maximales
- MEA
- sens
- des mesures
- mécanique
- moyenne
- Merck
- méthode
- souris
- micron
- Microscope
- minimum
- mélange
- ML
- Mode
- modèle
- MOL
- Stack monitoring
- Mois
- mois
- bouche
- en mouvement
- MS
- plusieurs
- Mutation
- Nationales
- National Institutes of Health
- Nature
- réseau et
- réseaux
- Neurones
- Nouveauté
- next
- nombre
- objectif
- obtenir
- obtenu
- of
- Olympe
- on
- ONE
- ouverture
- d'exploitation
- de commander
- Autre
- autrement
- du jour au lendemain
- paramètres
- parlement
- partie
- passé
- Courant
- effectuer
- phénix
- Physique
- pièces
- Plasma
- Plastique
- Platon
- Intelligence des données Platon
- PlatonDonnées
- Jouez
- plug-in
- Point
- des notes bonus
- portefeuille
- positionnée
- positions
- défaillances
- power
- La précision
- présenté
- Press
- la parfaite pression
- processus
- produire
- Produit
- Programme
- propriétés
- protocole
- protocoles
- à condition de
- impulsion
- pompe
- Lapin
- collectés
- RAT
- Tarif
- rapport
- nous joindre
- atteint
- réal
- réaliste
- récupération
- reflété
- en ce qui concerne
- régime
- région
- régions
- Inscription
- remplacé
- Rapports
- représenté
- un article
- laboratoires de recherche
- Résolution
- respectivement
- Réagir
- répondre
- réponse
- REST
- voitures classiques
- restauration
- restriction
- résultant
- RETINA
- Augmenter
- Rôle
- Salle
- mettre en déroute
- s
- même
- scénario
- calendrier
- SCI
- Sciences
- STARFLEET SCIENCES
- scripts
- Deuxièmement
- secondaire
- les sections
- choisi
- sélectif
- Sensibilité
- capteur
- Séquence
- Sérum
- Session
- brainstorming
- set
- en forme de
- Sigma
- Signal
- signaux
- Silicium
- similaires
- simulation
- site
- SIX
- Taille
- Peau
- Tranche
- petit
- Logiciels
- sur mesure
- Son
- Identifier
- Spatial
- groupe de neurones
- spécifié
- vitesse
- épi
- pointes
- Spot
- Diffusion
- Combos
- Étape
- Standard
- statistique
- acier
- stimulus
- Étude
- succès
- haut
- Surface
- suspension
- Suspensions
- commuté
- combustion propre
- Système
- réservoir
- Target
- ciblage
- Tâche
- Les technologies
- tester
- tests
- qui
- La
- La Région
- leur
- donc
- thermique
- Ces
- thompson
- milliers
- trois
- tridimensionnel
- порог
- Avec
- fiable
- tissus
- à
- Boîte à outils
- qualifié
- transférer
- procès
- essais cliniques
- Vérité
- ultrason
- us
- utilisé
- utilisateurs
- v1
- validé
- Plus-value
- Valeurs
- vanne
- VBA
- Vérification
- vérifié
- vision
- vivo
- volumétrique
- W
- Eau
- Vague
- weekend
- Semaines
- poids
- WELL
- qui
- blanc
- fenêtres
- comprenant
- dans les
- world
- code écrit
- zéphyrnet