Drahtlose elektrisch-molekulare Quantensignalisierung für die Apoptose von Krebszellen – Nature Nanotechnology

Neuauflage von Plato

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Reagenzien

Folgende Reagenzien wurden verwendet: Pferdeherz Cyt c (C7752, Sigma-Aldrich), EDC (E6383, Sigma-Aldrich), NHS (130672, Sigma-Aldrich), 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäurehydrat, 4-Morpholinethansulfonsäure (M8250, Sigma-Aldrich), l-Ascorbinsäure (A92902, Sigma-Aldrich), μ-Platte 24-Well schwarze ibiTreat-Oberfläche (IB-82426, Thistle Scientific), Hoechst 33342 (NucBlue Live ReadyProbes Reagent, R37605, Thermo Fisher Scientific), Actin unter Verwendung von Phalloidin–iFluor 488 Konjugat (23115, AAT Bioquest, Stratech), PrestoBlue HS Zelllebensfähigkeitsreagenz (P50200, Invitrogen), Calcein AM (C1430, Thermo Fisher Scientific), Propidiumiodid (P4170, Sigma-Aldrich), H2DCFDA (D399, Invitrogen), CellEvent Caspase -3/7 Green Flow Cytometry Assay Kit (C10427, Invitrogen), Zombie NIR Fixable Viability Kit (423105, BioLegend), CellEvent Caspase-3/7 Green ReadyProbes Reagenz (R37111, Invitrogen), CellLight Late Endosomes-GFP, BacMam 2.0 ( C10588, Thermo Fisher Scientific) und LysoTracker Green DND-26 (L7526, Thermo Fisher Scientific). Für die mit Carboxyl-PEG beschichteten GNPs oder Z ist keine Katalognummer verfügbar, da sie individuell angepasst und von Nanopartz bzw. Porphychem erworben wurden.

Synthese bifunktionalisierter bipolarer Bio-Nanoantennen aus Gold

Kugelförmige BSPs mit einem Durchmesser (d) von 100 nm und mit Thiol-Carbonsäure-PEG (SH-PEG-COOH; Molekulargewicht) abgedeckt M = 1 kDa, 2 kDa, 3.5 kDa und 5 kDa) mit einer PEG-Dichte von 1–1.5 nm² wurden von Nanopartz gekauft. Der r.Cyt c wurde durch Zugabe von 10 mg der oxidierten Form des Pferdeherz-Cyt erhalten c (o.Cyt c) in 5 ml l-Ascorbinsäurelösung (1 mg ml^-1 in PBS) und Reinigung durch Dialyse bei 4 °C unter dunklen Bedingungen für 36 Stunden, um überschüssige Ascorbinsäure zu entfernen. Der r.Cyt c und Z wurden mithilfe der EDC/NHS-Carbodiimid-Kupplungschemie kovalent an eine Carboxylgruppe an den Capping-Liganden von GNPs konjugiert. Kurz gesagt, 20 μL GNP-Lösung (3.6 mg mL).^-1 in Reinstwasser) wurde mit 20 μL EDC/NHS-Lösung in 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäurepuffer (10 mM, pH 5.5) in einer Konzentration von 30 und 36 mg mL^-1. Die Lösung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gemischt; Anschließend wurde 1 ml Waschpuffer (x 1 PBS mit 0.01 % (Gew./Vol.) Tween 20) zugegeben und die Lösung bei 450 °C zentrifugiertg für 20 Min. Der Überstand wurde verworfen und 20 μl r.Cyt c (1 mg ml^-1) und Z (0.5 mg mL^-1) wurden dem Pellet zugesetzt und mit einem Fisherbrand-Ultraschallbad (FB11201, 80 KHz, 50 % Leistung, 1 Minute) beschallt. Als nächstes wurde die Lösung 4 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Mischen inkubiert; Anschließend wurde 1 ml Waschpuffer zugegeben und die Lösung bei 450 °C zentrifugiertg für 20 Min. Um die vollständige Entfernung von ungebundenem r.Cyt c und Z, der Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Das erhaltene Pellet besteht aus mit r.Cyt konjugierten GNPs c und Z (GNP100@r.Cyt c@Z) wurde in PBS dispergiert und bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert.

Um die Kontrollproben von GNPs vorzubereiten, die kovalent mit nur einem Molekül konjugiert sind, werden entweder r.Cyt c (GNP100@r.Cyt c) oder Z (GNP100@Z) wurde während des EDC/NHS-Schritts nur eine dieser Verbindungen mit Konzentrationen von 0.25 mg mL eingeführt^-1 oder 0.1 mg ml^-1, jeweils. Das gleiche Protokoll wurde verwendet, um Bio-Nanoantennen mit unterschiedlichen GNP-Durchmessern (20 nm, 50 nm und 100 nm) und unterschiedlichen PEG-Längen (1 kDa, 2 kDa, 3.5 kDa, 5 kDa) zu synthetisieren. Die Konzentration von Cyt c und Z während des EDC/NHS-Schritts wurden optimiert (0.25, 0.5 und 1 mg mL).^-1), um ein ähnliches Bindungsverhältnis von Cyt zu erhalten c und Z pro BSP.

Charakterisierungstechniken

Dynamische Lichtstreuung und Zetapotentialmessungen

Der hydrodynamische Durchmesser (h_d) und Zetapotential (ζ) von Bio-Nanoantennen (in Reinstwasser) wurde mit einem Malvern Zetasizer Nano-ZS ((Malvern Instruments) gemessen.

Transmissionselektronenmikroskopie

Zur Aufnahme von TEM-Bildern wurde ein TEM-Instrument (JEOL 2000 FX TEM) verwendet, das mit einer Beschleunigungsspannung von 200 kV betrieben wurde. Die Proben wurden hergestellt, indem 10 μl Probe zweimal im Abstand von 400 Stunde auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter (1 Mesh, Agar Scientific) getropft wurden. Die Probe wurde vor der TEM-Bildgebung mindestens 30 Minuten lang getrocknet.

UV-sichtbare Absorptionsspektroskopie

UV-sichtbare Absorptionsspektren von in PBS dispergierten Bio-Nanoantennen wurden auf einem Cary 3500 UV-sichtbaren Instrument (Agilent Technologies) aufgezeichnet.

Circulardichroismus

Fern- und Nah-UV-Zirkulardichroismus-Spektren wurden bei 20 °C mit einem Chirascan-Zirkulardichroismus-Spektrophotometer (Applied Photophysics) aufgezeichnet, das mit einer Temperaturkontrolleinheit TC125 (Quantum Northwest) ausgestattet war. Die Proben wurden in 10 mM PBS bei pH 7.4 dispergiert. Für jede Probe wurden mindestens drei Spektren aufgenommen und gemittelt. Für die Zirkulardichroismusmessungen wurde eine Quarzküvette mit einer optischen Weglänge von 1 cm verwendet.

Zyklische Voltammetrie

Die elektrochemischen Analysen wurden mit einem Metrohm Autolab M204 Potentiostat durchgeführt, der mit einem Drei-Elektroden-System bestehend aus einer Platindraht-Gegenelektrode, einer Ag/AgCl-Referenzelektrode und einer ITO-Arbeitselektrode (Delta Technologies) ausgestattet war. ITO-beschichtetes Glas (10 mm × 20 mm) wurde mit Aceton und Wasser gewaschen, mit Argon getrocknet und zu einer elektrochemischen Zelle mit einer freiliegenden Arbeitsfläche von 38.5 mm zusammengebaut². Bifunktionalisierte bipolare Goldnanoelektroden wurden in PBS bis zu einer Endkonzentration von 25 μg mL dispergiert^-1 (bestimmt mittels UV-sichtbarer Spektroskopie). Die zyklische Voltammetrie wurde zwischen 1.2 V und –0.2 V mit unterschiedlichen Scanraten zwischen 50 mV s durchgeführt^-1 und 2 V s^-1. Wiederholte aufeinanderfolgende zyklische Voltammetriemessungen wurden mit einer festen Scanrate von 100 mV s durchgeführt^-1. Kontrollmessungen der zyklischen Voltammetrie wurden mit Carboxyl-PEG-modifizierten GNPs unter Verwendung von PBS als Leitelektrolyt durchgeführt.

Die heterogene Geschwindigkeitskonstante (k⁰) wurde nach der Methode von Nicholson und Shain berechnet⁴⁶. Der Rate-Transfer-Koeffizient, α, wurde aus der Scan-Rate-Studie berechnet (ergänzende Abbildung). 5). Die Steigung des Logarithmus der Abtastrate gegenüber der Differenz zwischen dem Spitzenpotential und dem formalen Potential der Zelle wird durch die Gleichung (2):

$${rm{Slope}}=-frac{2.3,{RT}}{alpha {nF}}$$

(2)

woher R ist die Gaskonstante, T ist Temperatur, n ist die Anzahl der bei der Redoxreaktion übertragenen Elektronen und F ist die Faraday-Konstante.

Allerdings wird zur Bestimmung die Methode von Nicholson und Shain verwendet ψ (ψ ist eine Funktion des Peakabstands) geht davon aus α = 0.5. Aber in dieser Arbeit ist der Wert von α ist unterschiedlich (Ergänzungstabelle 5); daher die Lavagnini-Methode⁴⁷ wird zur Berechnung verwendet ψ als Funktion des Peakabstands ΔE_p unter Verwendung der Gleichung (3):

$$psi =2.18{left(frac{alpha }{uppi }right)}^{0.5}{{exp }}left[right.-left(frac{{alpha }^{2}F}{{RT}} right)nDelta {E}_{mathrm{{p}}}.$$

(3)

Dann k⁰ für die Nanoantennen wird mit der Gleichung berechnet (4):

$$psi ={k}^{0}{left[frac{{{uppi }}{{D}}{nv}{{F}}}{{{RT}}}right]}^{-0.5} $$

(4)

woher D ist der Diffusionskoeffizient.

Zelllinien

GIN-Zellen wurden aus dem durch 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) fluoreszierenden infiltrativen Tumorrand isoliert und GCE-Zellen wurden aus der zentralen Kernregion des Tumors von GBM-Patienten isoliert, die sich einer Operation im Queen's Medical Centre der University of Nottingham unterzogen hatten ( Nottingham, UK), unter Verwendung einer zuvor beschriebenen Methode²⁹. U251-Zelllinien mit geringer Passage (erworben von ATCC) und vom Patienten stammende GIN 28-, GIN 31-, GCE 28- und GCE 31-Zellen wurden in DMEM-Medium (Gibco), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin/ Streptomycin und 1 % l-Glutamin. Vom Menschen stammende kortikale Astrozyten (HCOA; Katalog-Nr. 1800, Chargen-Nr. 24490, ScienCell) und Kleinhirn-Astrozyten (HCEA; Katalog-Nr. 1810, ScienCell) wurden in Astrozytenmedium mit 2 % FBS, 1 % Astrozyten-Wachstumszusatz und 1 % kultiviert % Penicillin/Streptomycin von ScienCell. Die aus gesundem menschlichem Lebergewebe isolierten menschlichen intrahepatischen biliären Epithelzellen (HIBEpiC) wurden von Innoprot (P10654) erworben und in Epithel-Basalmedium mit 2 % FBS, 1 % Epithelzellwachstumszusatz und 1 % Penicillin/Streptomycin kultiviert. Alle Zellen wurden in einem Inkubator mit einer feuchten Atmosphäre, die 37 % CO enthielt, bei 5 °C gehalten₂. Die Zellen wurden routinemäßig (einmal im Monat) auf Mykoplasmen getestet und vor dem Mykoplasmentest eine Woche lang in einem antibiotikafreien Medium gezüchtet. Alle verwendeten Zellen waren frei von Mykoplasmen.

PrestoBlue HS-Assay für Biokompatibilitäts- und Stoffwechselaktivitätsstudien

Die Zellen (U251, HCOA, GIN und GCE) wurden in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 5 × 10 ausgesät³ Zellen pro Vertiefung und 24 Stunden lang anhaften gelassen. Das Medium wurde durch frisches Medium ersetzt, das GNP-Konjugate in unterschiedlichen Konzentrationen (25, 50 und 100 μg ml) enthielt^-1) und die Zellen wurden 8 Stunden lang inkubiert. Das Medium wurde entfernt, die Zellen mit PBS gewaschen und weitere 48 Stunden in frischem Medium inkubiert. Das Medium wurde durch ein Vollmedium mit 10 % PrestoBlue HS-Zelllebensfähigkeitsreagenz ersetzt und eine Stunde lang inkubiert, bevor die Fluoreszenz bei 590 nm und 610 nm (Anregung und Emission) in einem Tecan-Mikroplattenlesegerät (Infinite M Plex und Spark 10M) abgelesen wurde. In Kulturmedien gezüchtete Zellen stellten nur die Negativkontrolle dar. Die Werte werden relativ zur Negativkontrolle dargestellt. Die Daten werden als Durchschnitt eines dreifachen Experiments mit drei unabhängigen Wiederholungen dargestellt.

Zellassoziation mittels ICP-MS und Aufnahme mittels konfokaler Mikroskopie

GIN- und GCE-Zellen wurden mit einer Dichte von 24 × 1 in eine 10-Well-Platte ausgesät⁵ Zellen pro Vertiefung und 37 Stunden bei 24 °C inkubiert. Nach 24 Stunden wurde das Kulturmedium durch frisches Medium mit 25 μg ml ersetzt^-1 von GNP100@r.Cyt c@Z und 8 h inkubiert. Anschließend wurde das Medium entfernt und die Zellen mit PBS (300 μl, zweimal wiederholt) gewaschen. Die Zellen wurden trypsiniert und 50 μl Zellsuspension wurden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit und Zählung der Trypanblau-Zellen verwendet. Die verbleibende Zellsuspension wurde bei 300 °C zentrifugiertg für 5 Min. Das erhaltene Zellpellet wurde über Nacht mit 70 %iger Salpetersäure verdaut, mit Milli-Q-Wasser verdünnt, um die Säurekonzentration auf 2 % zu bringen, und für die ICP-MS-Analyse (iCAPQ, Thermo Fischer) verwendet.

Um die zelluläre Aufnahme der bipolaren Nanoelektrode zu bestätigen, wurden die Zellen nach 8-stündiger Exposition mit PBS (300 μl, zweimal) gewaschen, 4 Minuten lang mit 15 % Paraformaldehyd fixiert und zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellkerne wurden mit Hoechst 33342 und Aktin unter Verwendung des Phalloidin-iFluor 488-Konjugats angefärbt und 1 Stunde lang bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Nach zweimaligem Waschen der Zellen und Eintauchen in PBS wurde die Fluoreszenzbildgebung mit einem konfokalen Leica TCS SPE-Mikroskop durchgeführt. Die orthogonalen Abschnitte von z Es wurden Stapel erstellt und die Bilder mit ImageJ analysiert.

Studien zur Elektrostimulation

U251-, HIBEpiC-, GIN 28-, GIN 31-, GCE 28- und GCE 31-Zellen wurden in einer 24-Well-Platte (μ-plate 24-well black ibiTreat, Thistle Scientific) mit einer Dichte von 7.5, 10 × XNUMX ausgesät⁴ Zellen pro Vertiefung, während HCOA und HCEA in einer Dichte von 5 × 10 ausgesät wurden⁴ Zellen pro Well in einem Poly-l-Lysinbeschichtete 24-Well-Platte. Die Zellen wurden 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO inkubiert₂Anschließend wurde das Zellkulturmedium durch frisches Medium mit Bio-Nanoantennen (25 μg ml) ersetzt^-1) und 8 Stunden lang inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen. Zwei Stahlelektroden (0.5 mm × 25 mm) wurden in einem festen Abstand (an gegenüberliegenden Seiten der Vertiefung und 10 mm voneinander entfernt) in jeder Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen platziert und in Zellkulturmedium getaucht. Die Elektroden wurden an einen Arbiträrfunktionsgenerator (AFG-21225, RS PRO) angeschlossen, um die erforderlichen Wechselstrom-Sinuswellensignale, Frequenz und Amplitude zu liefern. Die Zellen wurden mit Wechselstrom-EFs mit einer Frequenz von 3 MHz und einer Spitzenspannungsamplitude von 0.65 V cm stimuliert^-1 für einen Zeitraum von 2 h oder 12 h. Der EF zwischen den Elektroden wurde mit einem digitalen Oszilloskop (TDS 210, Tektronix) gemessen und die Temperatur alle 2 Stunden mit einer Infrarot-Laserpistole (IR-801, ATP) überwacht. Die Intensität des EF wird in Spitzenspannungsamplitude pro Zentimeter (V cm) ausgedrückt^-1). Die Stoffwechselaktivität der Zellen nach ES wurde mit einem PrestoBlue HS-Assay analysiert.

Calcein AM und Propidiumiodid Lebend-Tot-Assay

Unmittelbar nach der ES wurde das Medium entfernt und durch frisches Medium ersetzt, das gemischte Farbstoffe, 1 μM Calcein AM und 1 μg ml, enthielt^-1 Propidiumiodid gelöst und 30 Minuten bei 37 °C und 5 % CO inkubiert₂. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und frisches phenolrotfreies Medium wurde hinzugefügt. Die Zellen wurden mit einem Nikon Eclipse Ti-Fluoreszenzmikroskop mit GFP- und mCherry-Filtereinstellungen abgebildet. Die Populationen lebender und toter Zellen wurden mit der ImageJ-Software quantifiziert.

H₂DCFDA/DCF-Assay zur Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies

Die Zellen wurden mit nicht fluoreszierendem, zellpermeablem 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (H₂DCFDA, 5 μM) Sonde für 30 Minuten vor ES. Unmittelbar nach der ES wurden die Zellen mit PBS gewaschen. Die erzeugten reaktiven Sauerstoffspezies wandelten H um₂DCFDA in 2′,7′-Dichlorfluorescein. Die grüne Fluoreszenz von 2′,7′-Dichlorfluorescein wurde mit einem Nikon Eclipse Ti mit FITC-Filtereinstellungen nachgewiesen.

Caspase 3/7-Durchflusszytometrieanalyse des Zelltods

Unmittelbar nach der ES wurden die Zellen trypsinisiert und zentrifugiert (300°C).g für 5 Minuten), um ein Zellpellet zu erhalten. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit einem Farbstoff-Mastermix, der CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent (1:1,000) und Zombie NIR fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff (1:2,500) enthielt, 30 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurden die Zellen bei 300°C zentrifugiertg 5 Minuten lang gewaschen, mit PBS gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die Fluoreszenzsignale des Caspase-3/7-Farbstoffs (Anregung und Emission, 511 nm und 523 nm) und des Zombie-NIR-Farbstoffs (Anregung und Emission, 719 nm und 746 nm), die jeweils für apoptotische und nekrotische Zellpopulationen charakteristisch sind, wurden mit detektiert ein Sony ID7000 Spektraldurchflusszytometer. Zur Analyse der Daten wurde die Kaluza-Software (v.2.1) verwendet.

Caspase 3/7-Detektion mittels konfokalem Mikroskop

Unmittelbar nach der ES wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden mit 8 µM CellEvent Caspase-3/7 Green ReadyProbes-Reagenz in PBS mit 5 % FBS 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 4 Minuten lang mit 20 % Paraformaldehyd fixiert und anschließend zweimal mit PBS gewaschen. Später wurden die Zellen 594 Minuten lang bei 90 °C im Dunkeln mit dem Aktin-Färbe-Phalloidin-iFluor-37-Konjugat behandelt und erneut mit PBS gewaschen, gefolgt von einer 33342-minütigen Färbung mit Hoechst 10. Abschließend wurden die Zellen mit PBS (zweimal) gewaschen und mit einem konfokalen Leica TCS SPE-Mikroskop mit einem ×63-Objektiv unter Verwendung der Filtereinstellungen der Farbstoffe Alexa Fluor 488 und Texas Red 594 abgebildet.

Kolokalisierungsstudien

GIN- und GCE-Zellen wurden in einer Dichte von 4 × 10 ausgesät⁴ Zellen pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte und 37 Stunden lang bei 24 °C inkubiert. Nach 24 Stunden wurde das Kulturmedium durch frisches Medium mit CellLight Late Endosomes-GFP und BacMam 2.0 ersetzt und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO inkubiert₂. Später wurde das Medium durch frisches Medium mit 25 μg ml ersetzt^-1 von GNP100@r.Cyt c@Z und 8 h inkubiert. Unmittelbar nach der ES wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit einem konfokalen Leica-Mikroskop abgebildet. Für die lysosomale Färbung wurden die Zellen unmittelbar nach ES 100 Minuten lang mit Medium, das 26 nM LysoTracker Green DND-30 enthielt, inkubiert, gefolgt von Waschen und Bildgebung.

Genregulationsanalyse

Differenzielle Genregulationsanalyse

Unmittelbar nach dem ES (3 MHz, 0.65 V cm^-1, 2 Stunden) wurden die Zellen mit PBS gewaschen, trypsinisiert und zentrifugiert, um ein Pellet zu erhalten. Die Zellpellets wurden 5 Minuten lang in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zum Versand (in Trockeneis) an die Qiagen-Genomikanlage in Hilden, Deutschland, bei –80 ° C gelagert.

Probenvorbereitung

RNA wurde aus 200,000 Zellen mit dem RNeasy Micro (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem Elutionsvolumen von 14 µL isoliert.

Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung

Die Bibliotheksvorbereitung erfolgte mit dem QIAseq UPX 3′ Transcriptome Kit (Qiagen). Insgesamt 10 ng gereinigte RNA wurden in cDNA Next Generation Sequencing (NGS-Bibliotheken) umgewandelt. Bei der Reverse Transkription wird jede Zelle mit einer eindeutigen ID und jedes RNA-Molekül mit einem eindeutigen molekularen Index (UMI) versehen. Anschließend wird die RNA in cDNA (komplementäre Desoxyribonukleinsäure) umgewandelt. Die cDNA wurde amplifiziert, die PCR-Indizes (Polymerase-Kettenreaktion) hinzugefügt und die Bibliotheken gereinigt. Die Qualität der Bibliotheksvorbereitung wurde mittels Kapillarelektrophorese (Agilent DNA 7500 Chip) kontrolliert. Basierend auf der Qualität der Inserts und den Konzentrationsmessungen wurden die Bibliotheken in äquimolaren Verhältnissen gepoolt. Der/die Bibliothekspool(s) wurden mittels qPCR (quantitative Polymerasekettenreaktion) quantifiziert. Jeder Bibliothekspool wurde dann auf einem NextSeq-Sequenzierungsgerät (Illumina) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einer Leselänge von 100 bp für Read 1 und 27 bp für Read2 sequenziert. Rohdaten wurden demultiplext und FASTQ-Dateien für jede Probe mit der Software bcl2fastq2 (Illumina) generiert.

Lesen Sie Demultiplexing, Kartierung und Quantifizierung der Genexpression

Das Tool „Demultiplex QIAseq UPX 3′ Reads“ der CLC Genomics Workbench v.20.0.4 wurde verwendet, um die Rohsequenzierungs-Reads entsprechend den Probenindizes zu demultiplexen. Der „Quantify QIAseq UPX 3′-Workflow“ wurde verwendet, um die demultiplexten Sequenzierungslesevorgänge mit Standardeinstellungen zu verarbeiten. Kurz gesagt, die Lesevorgänge werden mit ihrem UMI versehen und dann auf Poly(A)- und Adaptersequenzen, minimale Leselänge (15 Nukleotide), Lesequalität und mehrdeutige Nukleotide (maximal 2) zugeschnitten. Anschließend werden sie mithilfe ihrer UMI dedupliziert. Lesevorgänge werden in UMI-Gruppen gruppiert, wenn sie (1) an derselben Position beginnen, basierend auf dem Ende des Lesevorgangs, an den der UMI ligiert ist (d. h. Read2 für gepaarte Daten), (2) vom selben Strang stammen und (3 ) haben identische UMIs. Gruppen, die nur einen Read enthalten (Singletons), werden zu Nicht-Singleton-Gruppen zusammengeführt, wenn der UMI des Singletons durch Einführung eines Einzelnukleotidpolymorphismus in einen UMI einer Nicht-Singleton-Gruppe umgewandelt werden kann (die größte Gruppe wird ausgewählt). Die Lesevorgänge wurden dann auf das menschliche Genom hg38 abgebildet und mit der refseq GRCh38.p13-mRNA-Annotation (Messenger-Ribonukleinsäure) annotiert.

Der Algorithmus „Empirische Analyse von DGE“ der CLC Genomics Workbench v.21.0.4 wurde für die Differentialexpressionsanalyse mit Standardeinstellungen verwendet. Es handelt sich um eine Implementierung des von Robinson und Smyth entwickelten „Exakten Tests“ für Zweigruppenvergleiche⁴⁸ und in das EdgeR Bioconductor Package integriert (Robinson et al., 2010)⁴⁹.

Bei allen unbeaufsichtigten Analysen wurden nur Gene berücksichtigt, bei denen mindestens zehn Zählungen über alle Proben summiert wurden. Eine varianzstabilisierende Transformation wurde an der rohen Zählmatrix unter Verwendung der Funktion vst des R-Pakets DESeq2 v.1.28.1 durchgeführt. Für die Hauptkomponentenanalyse wurden etwa 500 Gene mit der höchsten Varianz verwendet. Die Varianz wurde unabhängig von den vordefinierten Gruppen berechnet (blind = WAHR). Etwa 35 Gene mit der höchsten Varianz zwischen den Proben wurden für die hierarchische Clusterbildung ausgewählt.

Differenzielle Genexpressions- und Gen-Set-Anreicherungsanalyse

Um unterschiedlich exprimierte Gene zu identifizieren, verwendeten wir den auf linearer Modellierung basierenden Limma-Algorithmus für den Transkriptomdatensatz⁵⁰. Kurz gesagt verglichen wir die unterschiedliche mRNA-Expression zwischen den verschiedenen Erkrankungen (behandelt vs. unbehandelt) über die Zelllinien hinweg. Die signifikant regulierten Gene wurden mit einer angepassten Auswahl ausgewählt P Wert unter 0.05 unter Verwendung der Benjamini-Hochberg-Korrekturmethode für Mehrfachtests. Die Anreicherungsanalyse der biologischen Prozesse wurde durch einen Algorithmus zur Gen-Set-Anreicherungsanalyse durchgeführt⁵¹. Kurz gesagt, die Gensätze wurden von MSigDB erhalten (Ref. ⁵²) und Anreicherungsanalysen wurden unter den verschiedenen Bedingungen über Zelllinien hinweg durchgeführt. Normalisierte Anreicherungswerte, P Werte ermittelt und angepasst P Für jeden Gensatz wurden Werte (berechnet mit einem Standard-Benjani-Hochberg-Verfahren) abgerufen. Die Gensätze mit höheren normalisierten Anreicherungs-Score-Werten und einem angepassten P Werte < 0.05 wurden als für eine bestimmte GBM-Region angereichert angesehen.

Um die zelllinienspezifischen Reaktionen auf die Behandlung zu identifizieren, wurden die wichtigsten unterschiedlich regulierten Signalwege (P Wert < 0.05) mit hohen normalisierten Anreicherungswerten über die Astrozyten- und GBM-abgeleiteten Zelllinien hinweg wurden ausgewählt.

Mathematische Modell der Stoffwechselaktivität, Laderate und Quantentunneln

Wir wollten ein mathematisches Modell entwickeln, um den charakteristischen exponentiellen Zerfall im Zusammenhang mit der Quantenmechanik zu unterstützen:

$$Ppropto {mathrm{{e}}}^{-alpha r}$$

(5)

woher P ist die Wahrscheinlichkeit des Elektronentunnelns; α ist die inverse Lokalisierungslänge, die mit der Energiebarriere skaliert, durch die ein Elektron tunneln muss; Und r ist die Länge der Energiebarriere. Wir definieren eine intrinsische Zelltodrate (direkt proportional zur Wahrscheinlichkeit, dass eine bestimmte Zelle innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens stirbt). r_d, von dem wir annehmen, dass es proportional zur Rate der Cytochrom-Aufladung ist. Dann ist die Anzahl der toten Zellen (D) zum Zeitpunkt t is

$$Dleft(tright)={int }_{!!0}^{t}{rm{d}}{t}^{{prime} }Aleft({t}^{{prime} }right){r }_{mathrm{{d}}}$$

(6)

woher A ist die Anzahl der lebenden Zellen. Die Stoffwechselaktivität ist gegeben durch

$$Mleft(tright)=frac{A(t)}{A(t)+D(t)}=frac{T-{r}_{mathrm{{d}}}{int }_{!!0 }^{t}{rm{d}}{t}^{{prime} }Aleft({t}^{{prime} }right)}{T}$$

(7)

woher T = D + A ist die Gesamtzahl der Zellen. Wenn wir die obige Gleichung lösen, finden wir das (Mleft(tright)={{mathrm{e}}}^{-{r}_{{mathrm{d}}}t}.) Daher ist die Laderate zu einem bestimmten Zeitpunkt (t) ist gegeben durch r_d ∝ –ln[M(t)].

Dunkelfeldmikroskopie und Plasmonenresonanzstreuspektroskopie

Die Messungen der Plasmonenresonanzstreuung wurden an einem inversen Dunkelfeldmikroskop (Eclipse Ti-U, Nikon) unter Verwendung einer 40-fachen Objektivlinse (numerische Apertur 0.6) und eines Dunkelfeldkondensors (0.8 < numerische Apertur < 0.95) durchgeführt. Als weiße Lichtquelle wurde eine Halogenlampe (100 W) verwendet, um Plasmonenresonanzstreulicht zu erzeugen. Die Dunkelfeldbilder wurden mit einer Echtfarben-Digitalkamera (Nikon DS-fi) aufgenommen. Das von den bifunktionalisierten Nanoantennen gestreute Licht wurde durch einen Monochromator (Gitterdichte 300 Linien mm) aufgespalten^-1; Blaze-Wellenlänge: 500 nm; Acton SP2300i, Princeton Instruments). Es wurde ein IsoPlane-320-Spektrometer verwendet und das geteilte Licht wurde von einem ladungsgekoppelten Gerät (Pixis 100BX, Princeton Instruments) gesammelt. Ein Wechselstrom-EF von 3 MHz bei 0.65 V wurde 10 Minuten lang angelegt und Streuspektren wurden überwacht (1,000 Bilder aufgezeichnet). Die Belichtungszeit betrug 500 ms. Die Proben für die Plasmonenresonanzstreuung wurden durch Immobilisierung von Nanoantennen auf ITO vorbereitet. Zunächst wurden ITO-Objektträger unter Ultraschallbehandlung mit Ethanol, Aceton und Wasser behandelt. Als nächstes wurden 50 µl Nanoantennenlösung 10 Minuten lang auf die ITO-Objektträger getropft, gefolgt von einem einstufigen Waschen und Spülen mit Wasser. Abschließend wurden die Objektträger mit N getrocknet₂ Gas.

Statistik und Reproduzierbarkeit

Alle statistischen Analysen wurden mit der Software GraphPad Prism v.9.4.1 (GraphPad Software) durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, werden alle Daten als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Für Antworten, die von zwei Variablen beeinflusst wurden, wurde eine zweifaktorielle ANOVA mit einem Tukey-Posttest verwendet. Der Wert P ≤ 0.05 wurde als signifikant angesehen. Die Anzahl der technischen Nachbildungen und unabhängigen Wiederholungen ist in den Figurenlegenden enthalten.