动物
实验是根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行的。 协议经当地动物伦理委员会(委员会查尔斯达尔文第 5 号,注册号 9529 和 26889)批准,并根据欧洲议会的指令 2010/63/EU 进行。 2 至 12 个月大的 Long–Evans 雄性大鼠和 57 周大的 WT 雄性小鼠 (C6BL/9J) 获自 Janvier Laboratories; P23H(第 1 行)雄性转基因大鼠(9-22 个月)在当地饲养。
质粒克隆和 AAV 生产
质粒含有 大肠杆菌 WT 形式的序列和 G22S 突变来自 Francesco Difato(Addgene 质粒 #107454 和 #107455)28. 为了靶向 RGC,SNCG 启动子31 被插入到含有 MSCL 序列融合到 tdTomato 基因和 Kir2.1 ER 输出信号,以驱动质膜上的表达。 AAV2.7m8 载体用于玻璃体内递送。 为了靶向 V1 皮质层中的神经元,SNCG 启动子被 CamKII 启动子取代,并选择了 AAV9.7m8 载体。 通过质粒共转染法制备重组 AAV,所得裂解物通过碘克沙醇纯化31.
美国刺激
使用了三个具有不同中心频率的聚焦 US 换能器:0.50 MHz(直径, Ø = 1.00″ = 25.4 毫米; 焦距, f = 1.25″ = 31.7 毫米)(V301-SU,奥林巴斯),2.25 兆赫(Ø = 0.50″ = 12.7 毫米, f = 1.00″ = 25.4 mm) (V306-SU, Olympus) 和 15.00 MHz (Ø = 0.50″ = 12.7 毫米, f = 1.00″ = 25.4 mm) (V319-SU, Olympus),对应于数值孔径 F/Ø = 1.25 和 2.00。 这三个聚焦换能器辐射的声场如图 XNUMX 所示。 1 (模拟)和扩展数据图。 3 (实验测量)。 TiePie Handyscope(HS5,TiePie Engineering)用于产生刺激波形,然后通过连接到换能器的 80 dB RF 功率放大器(VBA 230-80,Vectawave)。 使用 Royer–Dieulesaint 外差干涉仪在脱气水箱中测量换能器压力输出(焦点压力、三维 (3D) 压力图)47. 用于离体和体内刺激的美国刺激具有以下特征:1 kHz 脉冲重复频率,占空比为 50%,超声持续时间为 10 至 200 毫秒,刺激间隔为 0.01 至 2.00 秒。 0.11、0.88 和 0.30 MHz 换能器的峰值声压范围分别为 1.60 至 0.20 MPa、1.27 至 0.50 MPa 和 2.25 至 15.00 MPa。 相应的估计空间峰值脉冲平均强度 (Isppa) 值为 0.39–25.14、2.92–83.12 和 1.30–52.37 W cm - 2.
玻璃体内基因传递和视网膜成像
大鼠被麻醉48 和 AAV 悬浮液 (2 µl),含有 8 至 14 × 1010 病毒颗粒,被注入玻璃体腔的中心。 一个月后,使用 MICRON IV 视网膜成像显微镜(Phoenix Research Laboratories)和 Micron Discover v.2.2 对注射的眼睛进行 tdTomato 荧光成像。
MEA 记录
视网膜片被压平在滤膜(Whatman,GE Healthcare Life Sciences)上,并放置在 MEA(电极直径,30 µm;间距,200 µm;MEA256 200/30 iR-ITO,多通道系统)上,涂有聚-l-赖氨酸 (0.1%, Sigma),RGC 面向电极31. AMPA/红藻氨酸谷氨酸受体拮抗剂 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX, 25 μM, Sigma-Aldrich),NMDA 谷氨酸受体拮抗剂 [3H]3-(2-carboxypiperazin-4-yl) propyl -1-膦酸(CPP,10 μM,Sigma-Aldrich)和选择性 III 族代谢型谷氨酸受体激动剂, l-(+)-2-amino-4-phosphonobutyric acid (LAP4, 50 μM, Tocris Bioscience) 通过灌注线进行浴浴。 光刺激通过数字微镜显示器(Vialux;分辨率,1,024×768)耦合到白色发光二极管光源(MNWHL4,Thorlabs),聚焦在光感受器平面(辐照度,1 µW cm - 2). 美国换能器与一个定制的耦合锥耦合,该耦合锥充满脱气水并安装在垂直放置在视网膜上方的电动载物台(PT3/M-Z8,Thorlabs)上。 MEA 芯片和视网膜的反射信号用美国关键设备 (Lecoeur Electronique) 检测。 视网膜和换能器之间的距离等于换能器的焦距; 这已通过反射信号的飞行时间得到验证。 从带有 252 通道前置放大器和 MC_Rack v. 4.6.2(多通道系统)的 RGC 记录中,使用 Spyking CIRCUS 0.5 软件对尖峰进行分类49. 使用用 MATLAB (MathWorks 2018b) 编写的自定义脚本分析 RGC 响应,以将其分类为开、开-关或关,以及响应优势指数50. 延迟被计算为刺激开始与尖峰密度函数 (SDF) 的导数最大值之间的时间。 通过将阈值固定为 NT 细胞对 US 响应的延迟分布的最小值(45 毫秒),根据延迟(SL 和 LL)确定了两类 US 响应细胞。 我们确定了峰值 A 用于计算响应持续时间的 SDF,定义为 SDF 等于的两个时间点之间的时间间隔 A/e (哪里 A 是峰值去极化和 e 是欧拉数)。 Fano 因子量化尖峰计数变异性,计算为尖峰计数方差与平均值的比率。 根据细胞的最大放电率对两个激活细胞之间的欧几里得距离进行加权。 考虑到 2.25 和 15.00 MHz 的美国焦点大小以及 0.50 MHz 的 MEA 大小,计算了激活细胞数量与 MEA 芯片上刺激区域大小的比率,因为焦点更大比该频率的 MEA。 反应的中心是通过用每个细胞与其他反应细胞的距离对每个细胞的最大发射率进行加权来估计的,反应的位移被计算为两个反应中心位置之间的欧几里得距离。
颅内注射
AAV 悬浮液在大鼠的两个不同位置(2.6 mm ML,6.8 mm AP 和 3.1 mm ML,距前囟 7.2 mm AP)或小鼠的一个位置(2.5 mm ML,距前囟 3.5 mm AP)注射到右半球前囟)48. 对于大鼠注射,悬浮液(200 nl 含有 0.2–8.0 × 1015 病毒颗粒)在三个不同的深度(从皮层表面 1,100、1,350 和 1,500 µm)注射,微量注射泵控制器(Micro4,World Precision Instruments)以 50 nl min 的速率运行 - 1 和 10 µl Hamilton 注射器。 在小鼠中,AAV 悬浮液(1 µl 含有 0.2–8.0 × 1015 病毒颗粒)以 400 nl min 的速率从皮层表面 100 µm 处注射 - 1.
体内细胞外记录
AAV 注射后一个月,进行小开颅手术(5 × 5 mm2) 在右半球的 V1 以上进行48. tdTomato 荧光用 MICRON IV 视网膜成像显微镜和 Micron Discover v. 2.2 (Phoenix Research Laboratories) 检查。 一个 32 位点的 µEcog 电极阵列(电极直径,30 µm;电极间距,300 µm;FlexMEA36,MultiChannel Systems)位于转染区域或控制大鼠的类似区域。 MEA 记录是使用与大脑表面呈 16° 倾斜的 45 位点硅微探针(电极直径,30 µm;间距,50 µm;A1x16-5mm-50-703,NeuroNexus Technologies)和 MC_Rack v. 4.6.2 进行的。 使用三轴显微操纵器 (Sutter Instruments) 将 MEA 推进到皮质中 1,100 µm。 US 换能器通过一个定制的耦合锥与大脑耦合,耦合锥在机动平台上装满脱气水和 US 凝胶。 皮质和换能器之间的距离等于换能器的焦距。 视觉刺激是由白光准直发光二极管(MNWHL4,Thorlabs)产生的,距离眼睛 15 厘米(4.5 mW cm - 2 在角膜)。 使用 32 通道和 16 通道放大器(型号 ME32/16-FAI-μPA,MultiChannel Systems)将录音数字化。 µEcog 记录使用定制开发的 MATLAB 脚本进行分析,MEA 记录使用 Spyking CIRCUS 软件和定制开发的 MATLAB 脚本进行分析。 响应持续时间计算为皮质诱发电位等于的两个时间点之间的间隔 A/e. 激活区域被定义为伪彩色激活图的区域,在该区域上,峰值去极化超过了计算为信号的 2 × sd 的背景噪声水平。 通过根据每个电极与其他电极的距离对每个电极的峰值去极化进行加权来估计响应中心。 移动超声换能器时其相对位移计算为两个位置的欧氏距离。 对于皮质内记录,细胞潜伏期估计为刺激开始与 SDF 导数最大值之间的时间。
用于体内行为测试的手术
C57BL6J小鼠皮下注射丁丙诺啡(0.05 mg·kg - 1)(Buprécare,Axience)和地塞米松(0.7 mg kg - 1) (Dexazone, Virbac)。 动物用异氟醚麻醉(5% 诱导和 2% 维持,在空气/氧气混合物中),剃掉头部并用消毒液清洁。 将动物头部固定在带有异氟醚输送系统和眼药膏的立体定向框架上,并在眼睛上涂上黑色组织。 体温保持在37°C。 局部注射利多卡因(4 mg·kg - 1) (Laocaïne, Centravet),在皮肤上做了一个切口。 经过小开颅手术(约 5.0 × 5.0 mm2) 在右半球 (1 毫米钢钻) 的 V0.5 以上进行, 并应用了皮质缓冲器。 皮质覆盖有 TPX 塑料片(125 µm 厚)并用牙科丙烯酸粘固剂 (Tetric Evoflow) 密封。 对于行为实验,然后用牙科粘固剂 (FujiCEM 2) 将用于头部固定的金属头杆 (PhenoSys) 粘在左半球的头骨上。 将动物置于恢复室中,在眼睛上皮下注射生理血清和软膏(Ophtalon,Centravet)。 在手术后监测期间注射丁丙诺啡。
鼠标行为测试
小鼠被置于限水计划中,直到它们达到其体重的大约 80-85%。 适应测试条件后36,通过执行自愿检测任务训练小鼠对 LS 做出反应:舔水龙卷(钝的 18 号针头,距离嘴大约 5 毫米)以响应白光全场刺激(200 和 50 毫秒长)左眼(用托吡卡胺、Mydriaticum Dispersa 扩张)每个刺激持续时间超过 35 次试验,因此每天进行 70 次试验。 灯亮起 4 毫秒后,通过校准水系统自动分配水 (~500 μl)。 行为协议和舔检测由定制系统控制36. 接下来的四天(周末休息两天),在三个不同的压力值(1、50 和 0.2 MPa)下,美国刺激在 V0.7 上传递 1.2 毫秒。 这些压力值每天以不同的顺序传递(每次 35 次试验)。 试验间隔随机变化,范围在 10 到 30 秒之间。 15 MHz US 换能器通过一个装满水和 US 凝胶的定制耦合锥耦合到大脑。 通过计算小鼠进行预期舔(在刺激开始和水阀打开之间)的试验次数来计算成功率。 预期舔率(图 6e)通过从试验的预期舔率中减去自发舔率(在每个个体刺激开始前的所有 1 秒时间窗上计算)来计算会话(图 XNUMX)。 6a) 对于所有试验) 并乘以成功率。 通过确定刺激开始后第一次预期舔的时间来计算舔潜伏期。 保留用于分析的小鼠在 LS 后的第四天表现出优于或等于 60% 的成功率。 然后,根据使用 ROUT 方法进行的异常值识别,排除了表现出强迫性舔食行为的轻度或美国会话(Q = 1%)在会话的自发舔率上,在刺激开始前的 1 s 时间窗口内对会话的所有试验的测量值进行平均。
免疫组织化学和共聚焦成像
将样品在 4°C 下与视网膜单克隆抗 RBPMS 抗体(1:500,兔;ABN1362,默克密理博)孵育过夜31, 用单克隆抗 NeuN 抗体(1:500,小鼠,克隆 A60;MAB377,默克密理博)用于脑切片48. 然后将切片与与 Alexa Fluor 488(1:500,驴抗小鼠和驴抗兔 IgG 488,多克隆;分别为 A-21202 和 A-21206,Invitrogen)和 DAPI(1:1,000)偶联的二抗孵育; D9542, Merck Millipore) 在室温下放置 1 小时。 使用具有 ×1000 物镜的 Olympus FV20 共聚焦显微镜(数值孔径为 20 的 UPLSAPO 0.85XO)获取平装视网膜和脑切片的图像(FV10-ASW v. 4.2 软件)。
在用斐济 (ImageJ v. 1.53q) 处理的共聚焦图像上,使用“分析粒子”插件自动计算 RBPMS 和 NeuN 阳性细胞。 细胞由两个不同的用户使用“细胞计数器”插件手动计数。 通过在至少四个随机选择的 0.4 mm 转染区域中获取共聚焦堆栈来进行量化2 (扩展数据图 1). 对于 V1 神经元,为每只动物选择了具有最大 tdTomato 荧光区的矢状脑切片。 在 V1 中手动定义感兴趣区域,并在至少六个随机选择的 0.4 mm 区域中进行量化2.
超声引起的组织加热模拟
一个三重过程用于热效应的估计:(1)模拟由三个换能器产生的声场,具有真实的声学参数; (2) 验证非线性声学在传热中没有起到重要作用; (3) US 在本研究中使用的参数的线性范围内在焦点处引起的热传递和温度升高的真实模拟。
对于非线性模拟,我们使用 MATLAB 的 k-Wave 工具箱,通过在三个维度上定义换能器的几何形状并使用以下传播介质(水)参数:声速, c = 1,500 毫秒 - 1; 体积质量, ρ = 1,000 公斤米 - 3; 非线性系数, B/A = 5; 衰减系数, α = 2.2×10 - 3 分贝厘米 - 1 兆赫–y; 衰减系数的频率幂律, y = 2(参考。 51). 我们使用 3 个周期的长脉冲串模拟了准单色 50D 波场; 这给了我们三个维度的最大压力场以及焦点处的波形。 通过调整输入压力(模拟换能器的激励)以达到使用真实换能器在水箱中测量的焦点处的压力来校准模拟。 半峰全宽 (FWHM) 焦斑直径 x–y 平面为 4.360、1.610 和 0.276 mm,长轴的长度在 x–z 对于 32.3、20.6 和 3.75 MHz 换能器,平面分别为 0.50、2.25 和 15.00 mm(图 XNUMX)。 1b-d). 通过估计焦点处波形的相对谐波含量来评估非线性效应。 在图 15 MHz 聚焦传感器示例中。 1d,比较了焦点处的实验信号和模拟信号,发现它们高度一致(扩展数据图 XNUMX)。 4a). 此外,二次谐波的幅度比基波低 19.8 dB(模拟情况下为 20.9 dB),这意味着如果基波能量为 E, 二次谐波有能量 E/95(扩展数据图。 4b). 因此,我们可以合理地忽略热效应计算中的非线性效应,因为它们约占所涉及能量的 1%。 在 0.5 MHz 和 15.0 MHz 下得出了相同的结论。 线性波传播近似大大降低了模拟的计算成本。 使用 MATLAB 中的 Field II 工具箱进行线性传播仿真52,53,在单色模式下,具有与 k 波(水)相同的介质属性,以获得 3D 最大压力场。 这些最大压力场用于构建热源项 (Q_{mathrm{US}} = frac{{alpha _{mathrm{np}}p_{mathrm{max}}^2}}{{rho _mathrm{b}c_mathrm{b}}}),其中 αnp 是大脑在所考虑频率下的吸收系数(59.04 Np m - 1 在 15 MHz,从计算 α脑 = 0.21 分贝厘米 - 1 兆赫–y 和 y = 1.18), 大脑体积质量 ρ脑 = 1,046 公斤米–3, 脑音速 c脑 = 154 秒 - 1 和 p最大 是 3D 最大压力场。 该源项随后用于求解 Penne 生物热方程 (rho _{mathrm{brain}}C_{mathrm{brain}}timesfrac{{partial T}}{{partial t}} = mathrm{div}left( {K_mathrm{t}timesnabla T} right) – rho _{ mathrm{blood}}C_{mathrm{blood}}P_{mathrm{blood}}left( {T – T_mathrm{a}} right) + Q) 在 k-Wave 中, C脑 是血液比热容(3,630 J kg - 1 °C - 1), Kt 是脑导热系数(0.51 W m - 1 °C - 1), ρ血液 是血液密度(1,050 kg m - 3), C血液 是血液比热容(3,617 J kg - 1 °C - 1), P血液 是血液灌注系数(9.7×10 - 3 s - 1), Ta 是动脉温度 (37 °C), Q = QUS + ρ脑γ脑 和 γ脑 是脑组织产生的热量(11.37 W kg - 1)(参考。 54,55). 脑温度的初始条件设置为 T0 = 37°C。
该模拟对应于给定温升的最坏情况。 (1) 仅在水中模拟声传播(非降额值),具有较低的衰减系数(2.2 × 10 - 3 分贝厘米兆赫 - 2.00) 比大脑 (0.59 dB cm MHz - 1.27),即使传播的一部分发生在大脑内。 这 p最大 因此,地图被高估了。 (2) 仅在脑组织中模拟热吸收,具有较高的吸收系数(0.21 dB cm MHz - 1.18) 比水大,即使最大压力场的一部分实际上位于声耦合锥的水中。 所以, QUS 被稍微高估了。 我们绘制了三个空间维度和时间的温度图,并寻找最大温度上升点(扩展数据图 XNUMX)。 4c-f).
统计分析
使用 Prism 软件(Prism 9,GraphPad)进行统计分析。 除非另有说明,否则数值在图和文本中表示为平均值±平均值的标准误差 (sem)。 数据在未配对的 Welch 中进行了分析 t-测试(双尾)或未配对的多重测试 t-使用 Sidak–Bonferroni 校正进行多重比较测试。 图例中提供了统计测试。
报告摘要
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- Sumber: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01359-6
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