Mikroakışkanlarda nanoplazmonik amplifikasyon, patojenlerden nükleik asit biyobelirteçlerinin hızlandırılmış kolorimetrik miktarını mümkün kılar – Nature Nanotechnology

Çalışma tasarımı

Bu çalışma McGill Araştırma Etik Ofisi (Kurumsal İnceleme Kurulu, A03-M24-21B) tarafından onaylanmıştır. Bakım noktasında solunum yolu enfeksiyonlarının moleküler tespiti için evrensel bir platform geliştirilmesi amaçlandı. Plazmonik olarak geliştirilmiş RT-LAMP testlerine dayalı hızlı teşhis için H1N1 influenza A, SARS-CoV-2 RNA ve SARS-CoV-2 ısıyla inaktive edilmiş viral partiküller kullandık. RT-LAMP testleri için negatif kontroller olarak MERS-CoV RNA ve HCoV-229E RNA kullanıldı. Ayrıca, ilgili SARS-CoV-2 varyantlarının spesifik tespiti için bir RCA testi kullanıldı. Son olarak, hasta örneğinde kontrol olarak Üniversite Sağlık Ağı'nın PRESERVE Pandemic Response Biobank'ından alınan kimliği belirsiz 33 SARS-CoV-2-pozitif insan numunesi (RT-PCR doğrulanmış) ve kontrol olarak 15 SARS-CoV-2-negatif numune kullandık (qPCR doğrulandı) çalışmak. İlkenin kanıtı olarak, DNA profillemesi E. coli ve MRSA, LAMP deneyleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Pseudomonas aeruginosa LAMP tahlilleri için negatif kontrol olarak kullanıldı. Bu çalışma, Nisan 2020'den Aralık 2022'ye kadar Kanada'nın Montreal kentinde gerçekleştirildi.

Malzemeler

Malzemeler şu şekilde temin edildi: polistiren nanoboncuklar (polistiren partiküller (PS-R); Mikro Partikül); sentetik SARS-CoV-2 RNA (Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC); Cedarlane); SARS-CoV-2 B.1.1.7 Alfa değişken RNA (ATCC VR-3326D; Cedarlane); MERS-CoV (ATCC VR-3248SD; Cedarlane); ısıyla inaktive edilmiş SARS-CoV-2 (ATCC VR-1986HK; Cedarlane); ısıyla inaktive edilmiş H1N1 influenza A, NY/01/09 suşu (0810248CFHI; Cedarlane); Ve E. coli (no. 211540, Merlan Scientific). Kolorimetrik RT-LAMP ana karışımı ve HiFi Taq DNA Ligaz enzimi (New England Biolabs); PLP'ler, RCA primerleri ve sentetik cDNA SARS-CoV-2 hedefleri, MgCl₂, KCI, nikotinamid adenin dinükleotid (NAD) ve Triton X-100 (Sigma Aldrich); ve LAMP primerleri ve ditiyotreitol (DTT) (Thermo Fisher Scientific) kullanıldı. Sağlıklı insan havuzlanmış tükürüğü (IRHUSL50ML) ve sağlıklı insan tek donör tükürüğü (IRHUSLS5ML), Innovative Research'ten satın alındı ​​ve vardıklarında -80 °C'de saklandı. SARS-CoV-2 varyantı (Omicron, Delta, Eta ve Gamma) RNA örnekleri, McGill Üniversitesi'ndeki (Vidal Lab) ortak laboratuvardan temin edildi. HCoV-229E RNA, Yahudi Genel Hastanesi'ndeki (C. Liang laboratuvarı) Lady Davis Tıbbi Araştırma Enstitüsü'ndeki ortak laboratuvardan elde edildi. MRSA DNA'sı ve P. aeruginosa DNA, McGill Üniversitesi Sağlık Merkezleri (MUHC) araştırma enstitüsündeki D. Nguyen laboratuvarından elde edildi. Tüm tahliller, UltraPure DNase/RNase içermeyen damıtılmış su (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak hazırlandı.

Primerler ve problar

Bu çalışmada kullanılan SARS-CoV-2 RT-LAMP primerleri Yu ve diğerleri tarafından tasarlanmıştır.³² hedeflemek RdRp genomun ORF1ab'sindeki gen (DSÖ tarafından SARS-CoV-2 tespiti için hedef gen olarak önerilir)³¹. Primer seçiciliği, bir jel elektroforez deneyi ile doğrulandı (Ek Şekil XNUMXa). 16a). Primerlerin bileşimleri ve konsantrasyonları Ek Tabloda mevcuttur. 6.

H1N1 RT-LAMP primerleri, H1N1 IAV'nin hemaglutinin (HA) geninin yüksek oranda korunmuş sekanslarını hedefleyen New England Biolabs LAMP Primer Tasarım Aracı ile tasarlanmıştır. LAMP tanıma kısmı, Temel Yerel Hizalama Arama Aracı tarafından değerlendirildi⁵⁰ve Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi tarafından sağlanan 100 isabette dizi varyasyonu görülmedi. Aday gösterilen LAMP primerleri, Primer Explorer V5 protokolü tarafından sunulan optimize edilmiş parametrelere göre seçildi. Primer seçiciliği, bir jel elektroforez deneyi ile daha da doğrulandı (Ek Şekil XNUMXa). 16b). Primerlerin bileşimleri ve konsantrasyonları Ek Tabloda mevcuttur. 7.

P681H ve L452R mutasyon bölgeleri CoV-GLUE-Viz ve GISAID araçlarına göre belirlendi^36,51ve PLP tanıma parçaları, mutasyonlara özgü olacak şekilde tasarlanmıştır.³⁶. Ek olarak, WT SARS-CoV-2 tespiti için PLP hedef bölgesi şuydu: RdRp SARS-CoV-2 LAMP primerleri için hedefleme bölgesi ile aynı olan gen. PLP'ler, SNP'nin, bir hedef sarmalda fosforile edilmiş 3' ucunun yanında baz çiftli ligasyon bağlantı noktasında 5'-hidroksil grubu sağlayan PLP'nin yukarı akışı tarafından ayırt edilecek şekilde tasarlanmıştır. SNP tespiti üzerine PLP döngüselleşmesinin doğruluğu, New England Biolabs tarafından sağlanan Termostabil Ligaz Reaksiyon Sıcaklık Hesaplayıcısı kullanılarak belirlenmiştir. Daha sonra, özellikle PLP tanıma sitesinde istenmeyen ikincil yapıyı önlemek için PLP'ler Mfold web sunucusu kullanılarak değerlendirildi. RCA ileri ve geri primerleri, PLP'lerin iki spesifik kolunu tamamen birbirine bağlayan PLP'lerin ayırıcı kısmına hibritlenecek şekilde tasarlanmıştır. PLP seçiciliği, bir jel elektroforez deneyi ile doğrulandı (Ek Şekil XNUMXa). 21). PLP bileşimleri ve konsantrasyonlarının yanı sıra RCA primer bileşimleri ve konsantrasyonları ve cDNA bileşimi Ek Tablolarda mevcuttur. 8-10.

Bu çalışmada kullanılan bakteriyel LAMP primerleri Hill ve ark.⁵² hedeflemek için E. coli malB gen ve Chen ve ark.⁵³ MRSA'yı hedeflemek için MecA gen. Primerlerin bileşimleri ve konsantrasyonları Ek Tablolarda mevcuttur. 11 ve 12.

Tahlil hazırlığı

RT-LAMP deneyleri için 20 ul'lik standart bir reaksiyon hacmi kullanıldı. Bu hacim 2 µl x10 primer karışımı, 10 µl x2 ana karışım, 7 µl RNaz içermeyen su ve 1 µl RNA örneğinden oluşuyordu. Isı ile inaktive edilmiş viral numuneler ilk olarak 95 °C'de 3 dakika boyunca termal olarak parçalandı ve ardından tahlil ile karıştırıldı. Bunu, farklı numuneler için zamana karşı renk değişimini görselleştirmek üzere farklı periyotlar için 65 °C'de inkübasyon izledi.

PLP ligasyon reaksiyonu, 10 ul SARS-CoV-1 RNA genomunun sentetik cDNA'sı, 2 ul 1 uM PLP, 1 ul UltraPure damıtılmış su ve 2 ul x5 no-Tris-HCl HiFi dahil olmak üzere 2 ul'lik nihai bir hacimde gerçekleştirildi. Taq DNA Ligaz ligasyon solüsyonu (20 mM MgCl₂, 20 mM KCl, 2 mM NAD, %0.1 Triton X-100, 20 mM DTT, pH 8.50) ve 1 µl HiFi Taq DNA Ligaz enzimi. Ligasyon karışımı önce DNA denatürasyonu için 95 dakika 5 °C'de inkübe edildi ve daha sonra PLP'lerin cDNA ile hibritleşmesine izin vermek için PLP tavlama sıcaklıklarına (sırasıyla P60H, L58R ve WT PLP'ler için 55, 681 ve 452 °C'dir) soğutuldu ve bir termocycler'da (Analytik Jena) HiFi enzimi aracılığıyla ligatlayın. Daha sonra ligasyon reaksiyonu, 12 ul nihai hacimde 2 ul WarmStart Kolorimetrik LAMP ×1.6 Ana Karışım ve 24 uM RCA ters ve ileri primerleri kullandı. RCA amplifikasyon reaksiyonu, farklı numuneler için zamana karşı renk değişimini görselleştirmek için farklı periyotlarda 65 °C'de gerçekleştirildi.

Bakteriyel DNA ekstraksiyonu için, E. coli örnekler gece boyunca 37 °C'de Luria Broth ortamında kültürlendi. Bakteri konsantrasyonu, bir Spectronic 21D spektrofotometre kullanılarak belirlendi. 10'luk farklı konsantrasyonların alikotları⁷ CFU ml^-1, 10⁵ CFU ml^-1, 10⁴ CFU ml^-1, 10³ CFU ml^-1, 10² CFU ml^-1 ve 10 CFU ml^-1 askıya alınarak hazırlandı E. coli Luria Broth ortamındaki kültürler. E. coli Kültürler 95 °C'de 10 dakika kaynatılarak DNA ekstrakte edildi. MRSA DNA'sı McGill Üniversitesi Sağlık Merkezi'nden kimyasal lizis yöntemi kullanılarak elde edildi. Tüm DNA örneği konsantrasyonları, bir Nanodrop 2000 spektrofotometre kullanılarak ölçüldü ve istenen konsantrasyonları elde etmek için Universal Buffer 48 (Bio Basic) içinde süspanse edildi.

SARS-CoV-2 için QolorEX testi, 8 × 10'lık eklenmiş solüsyonları (RNaz içermeyen su ve sağlıklı tükürük) test etti⁵ RNA, μl'yi kopyalar^-1 5 RNA kopyasına kadar μl^-1 SARS-CoV-2 RNA ve 90 viral partikül µl^-1 0.01 viral parçacıklar ul^-1 ısıyla inaktive edilmiş SARS-CoV-2'nin biyolojik olarak alakalı bir aralığa sığması için. Benzer şekilde Delta B.1.617.2, Omicron B.1.1.529, Omicron BA.4, Omicron BA.2.21, Omicron BA.5.2, Omicron BA.5.1.1, Eta B.1.525 ve Gamma P için çalışma yapılmıştır. .1 ile 8 × 10⁵ RNA, μl'yi kopyalar^-1 10 için⁴ RNA, μl'yi kopyalar^-1.

H1N1 için QolorEX testi, 8 × 10'lık eklenmiş çözeltileri (RNaz içermeyen su ve sağlıklı tükürük) inceledi.⁵ RNA, μl'yi kopyalar^-1 5 RNA kopyasına kadar μl^-1 H1N1 influenza A RNA'sının. Seçicilik çalışmaları için, 2 x 229'da çoklu virüslerden (SARS-CoV-8, MERS-CoV ve HCoV-10E) RNA kullanıldı.⁵ RNA, μl'yi kopyalar^-1.

için QolorEX testi E. coli 7.2 × 10'lık eklenmiş çözeltiler (RNaz içermeyen su) üzerinde çalışıldı⁶ gDNA ml'yi kopyalar^-1 7.2 gDNA kopya ml'ye^-1, 0.0343 ng μl'ye eşdeğer^-1 3.43 × 10'a^-8 ng μl^-1 of E. coli DNA. Seçicilik çalışmaları için, çoklu bakterilerden DNA (E. coli, MRSA ve P. aeruginosa) 10 konsantrasyonunda test edildi² gDNA, μl'yi kopyalar^-1.

MRSA için QolorEX testi, 10'luk eklenmiş çözeltileri (RNaz içermeyen su) inceledi.⁵ gDNA ml'yi kopyalar^-1 1 gDNA kopya ml'ye^-1, 3.05 × 10'a eşdeğer^-4 ng μl^-1 3.05 × 10'a^-9 ng μl^-1 MRSA DNA'sının. Seçicilik çalışmaları için çoklu bakterilerden (MRSA, E. coli ve P. aeruginosa) 10 konsantrasyonunda test edildi² gDNA, μl'yi kopyalar^-1.

QolorEX RCA testi, 8 × 10'lık eklenmiş solüsyonlarda (RNaz içermeyen su ve sağlıklı tükürük) yapıldı.⁵ cDNA, µl'yi kopyalar^-1 5 cDNA kopyası µl^-1 P681H, L452R ve WT SARS-CoV-2 dizilerinin sentetik cDNA'sının. Seçicilik için P681H PLP, P681H, WT-P681H ve L452R cDNA varlığında değerlendirildi. Aynı strateji, L452R, WT-L452R ve P452H cDNA hedeflerinin yanı sıra WT, P681H ve L681R cDNA dizilerinin varlığında WT PLP kullanılarak L452R PLP'nin seçicilik testi için kullanıldı. Tüm cDNA hedefleri, 10 konsantrasyonlarda değerlendirildi.⁵ cDNA, µl'yi kopyalar^-1.

QolorEX otomatik numune işleme ve görüntüleme kutusu

Taşınabilir görüntüleme kurulumunun üç ana bileşeni vardır: epi-aydınlatma görüntüleme kurulumu, sıvı işleme modülü ve otomasyon bileşenleri (Ek Şekil XNUMX). 1). Kurulumun dış muhafazası, 3 mm katman çözünürlüğünde kaynaşmış biriktirme modelleme 3D baskı (Prusa I3 Mk0.3, Prusa) ile tamamen üretilmiştir.

Epi-aydınlatmalı görüntüleme kurulumu, tahlil solüsyonunun kolorimetrik değişimini yakalamak için tasarlanmıştır. Görüntüleme kurulumunda bir aydınlatma modülü ve bir görüntü yakalama ve işleme modülü bulunur. Görüntü yakalama için yoğunlaştırıcı lens olarak bir ×20 objektif (TU Plan Fluor EPI ×20, Nikon) kullanıldı. Kullanılan tüm optik bileşenler Thorlabs'tan temin edildi. Nihai görüntü bir CMOS sensörüne (Sony IMX477R, 12.3MP, Raspberry Pi.) yansıtılır ve Raspberry Pi 4 (Raspberry Pi) tarafından işlenir.

Proses otomasyonu için, sıvı işlemede birden çok adımı gerçekleştiren beş lineer aktüatör (Actuonix) kullandık (Ek Şekiller. 1-3). Kurulum, numune parçalanması için portatif bir lehim havyası (TS-100) olan bir ısıtıcı modül kullanır. Bir XY algılama odalarının farklı iç ve iç bölgelerini taramak için çeviri aşaması kullanıldı. Bir kademeli motor (FUYU) tarafından çalıştırılan doğrusal olarak yönlendirilen bilgisayarlı bir sayısal kontrol aşaması kullandık. Hem aktüatör sistemi hem de sahne bir Arduino UNO mikrodenetleyici (Arduino) ile kontrol edilir. İki ısıtma elemanı, iki kanallı bir röle modülü (Yizhet) ile kontrol edilir. Sistemimizdeki verilerin otomatik aktarımı ve analizi, bir Raspberry Pi 4 (Raspberry Pi) mikrodenetleyicisi tarafından kontrol edilmektedir. Sonuçlar, MIT App Inventor tarafından tasarlanan bir uygulamada görüntülenir (Ek Şek. 2).

Mikroakışkan kartuş ve plazmonik platform üretimi

Üretim süreci yerleşik bir protokolü takip etti^27,54,55 ve ayrıntılı olarak Ek bilgi (Ek Şekil. 5). Kısaca, mikroakışkan kartuş, altı inçlik bir silikon gofreti temel alır. Engellenen ısıtıcı elemanı ve mikroakışkan özellikleri modellemek için üç aşamalı bir litografi işlemi kullanılır. İlk olarak, ısıtıcı (genişlik, 400 µm) ve ped (uzunluk, 5 mm; genişlik, 2 mm) özelliklerini, istenen desenlere sahip bir fotomaske aracılığıyla bir fotorezist katmana aktarmak için bir litografi adımı gerçekleştirilir. Bunu, doğal oksidi çıkarmak için bir tamponlu oksit asitleme ve 200 nm'lik bir silikon asitleme için bir potasyum hidroksit asitleme takip eder. Daha sonra, ısıtıcı elemanların kazınmış yivlerde seçici olarak bırakılması için bir kaldırma işlemi gerçekleştirilir. Bu, ikinci bir litografi adımıyla başlar ve ardından Temescal BJD 240 kullanılarak 1800 nm Al'lik bir elektron ışını biriktirme ile başlar. Buna göre, kalkış, uygun sökücüye daldırılarak tamamlanır. Ardından, son litografi adımı, giriş/çıkış portları dahil olmak üzere akışkan cihaz özelliklerini modellemek için gerçekleştirilir (çap 2 mm), lizis odası (uzunluk, 1.74 mm; genişlik, 1.5 mm; derinlik, 50 µm), karıştırma kanalları (genişlik, 200 µm; yükseklik, 50 µm) ve plazmonik pencere (uzunluk, 1.94 mm; genişlik, 1.5 mm; yükseklik, 50 µm) bir SU-8 katmanına (SU-8 2050). Daha sonra, altı inçlik gofret, bir Disco DAD 26.5 dilimleme testeresi kullanılarak ayrı yongalar (uzunluk, 35 mm; genişlik, 3240 mm) halinde kesilir.

Bunu, fabrikasyon olmayan bir nano desenleme tekniği kullanılarak mikroakışkan kartuştaki renge duyarlı platformların entegrasyonu izler. Bir su-hava arayüzünde koloidal kendinden montajlı bir nanopartikül tek tabakası geliştirmek için genel bir yaklaşım kullanılır.⁵⁶. Daha sonra, elde edilen petek yapıları, mikroakışkan kartuştaki renk algılama odasına aktarılır. Daha sonra, beyaz bir arka plana sahip ayarlanabilir bir lokalize yüzey plazmon rezonansı sağlamak için bir ZnO ince filmi (120 nm) ve ardından ince bir Al tabakası (10 nm) biriktirilir.

Polidimetilsiloksan (PDMS), elastomerin çapraz bağlayıcıya 10:1 oranı kullanılarak hazırlanır, bir desikatörde gazı giderilir ve gece boyunca 65 °C'de inkübe edilir. Sertleşen PDMS, mikroakışkan kartuş boyutunda kesilir ve giriş/çıkış portları, bir PDMS delici (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak delinir ve cihazları kapatmak için kullanılır. Kapatma işlemi, 50 saniyelik bir plazma işlemini ve ardından 105 °C'de gece boyunca inkübasyonu içerir. Daha sonra, stereolitografi (SLA) 3D baskılı kalıplar (Form 3, Formlabs) kullanılarak PDMS tabanlı bir vantuz tabakası üretildi. Vantuzlar daha sonra plazma ile aktive edilen bağlanma yoluyla akışkan PDMS katmanına bağlandı.

Numune işleme kartuşları (SLA 3D yazıcı kullanılarak 50 µm çözünürlükte üretilmiştir. z eksen), plazma ile aktive edilmiş bağlanmaya elverişli bir çift taraflı bant kullanılarak PDMS kaplı mikroakışkan çipe bağlanır ve 95 dakika boyunca 90 °C'de bir fırına yerleştirilir. 3D baskılı kartuşta, numune parçalanması için iki adet pirinç metal parça (McMaster Carr) bulunur.

Görüntü işleme

Görüntü işleme, incelenen her koşuldan üçlü görüntülerden oluşan bir veri seti ile başlar ve bunlar sırasıyla duyarlılık ve seçicilik için koşul başına toplam 40 ve 60 veri noktası oluşturmak üzere mini görüntülere bölünür. Spesifik olarak klinik numuneler için, her biri mikroakışkan çipin üç paralel toplama odasında incelendi; tüm görüntüler üç kopya halinde alındığından ve daha sonra bölündüğünden, her hasta örneği için toplam 90 veri noktası incelenmiştir. Tüm görüntü işleme, kahve halkası efektini ortadan kaldırmak için orijinal RGB görüntüsünün dıştaki %20'sinin kırpılmasından oluşur.⁵⁷, ardından 85 ile 140 (mavi aralık) arasında ton değerine sahip piksellerin kaldırıldığı ve görüntünün geri kalanının ortalama değeriyle değiştirildiği bir mavi filtre uygulaması gelir.⁵⁷. Mavi filtreli görüntü daha sonra %25 daha az doygun pikselleri filtrelenmiş görüntünün geri kalanının ortalama değeriyle değiştirerek eşiklenir. Son olarak, işlenmiş görüntü, Sergyan'da ayrıntılı olarak açıklanan formüllerin uygulanmasının sonucu olarak, çeşitli özelliklerin çıkarıldığı alt görüntülere kesilir.⁵⁸. Formüllerde yapılan değişiklik, gri tonlama yoğunluğunun her bir RGB kanalının yoğunluğuyla değiştirilmesinden oluşur.⁵⁸. Her bir alt görüntüden, RGB kanallarının her biri için ortalama renk değeri, standart sapma, mod, eğrilik, enerji ve entropiye karşılık gelen toplam 18 değer çıkarılır.

Gerçek insan örneklerinin otomasyonu için, görüntüleri virüs bulaşmamış ve virüs bulaşmış olmak üzere iki sınıfa ayırmak için denetimli bir makine öğrenme algoritması uyguladık (Ek Şekil XNUMX). 14). Hiperparametreleri ile radyal temel işlev (RBF) çekirdeğine sahip bir SVM oluşturuldu C ve bir Bayes aramasıyla değerlendirilen gama⁵⁹ ve beş katlı bir çapraz doğrulama yoluyla doğrulanan bir fazla uydurma yokluğu. Bu çalışma için veri tabanı, 33 enfekte ve 15 enfekte olmayan kontrol ile entegre edilmiştir; her numune için, çalışmalar üç kopya halinde yürütüldü ve zaman noktası başına toplam dokuz görüntü elde edildi. Veri kümeleri iki sınıfa ayrılır: virüs bulaşmamış (negatif) ve virüs bulaşmış (pozitif). Daha sonra farklı eğitim ve test setlerine ayrılırlar. Eğitim seti, 1, 7, 9, 11, 15, 19, 21, 23, 25, 29 ve 31 numaralı hastalardan alınan vektörlerin ve 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 numaralı hastaların vektörlerinin üçte ikisini içerir. 9, 11, 13 ve 15; test seti kalan vektörler tarafından entegre edilir. SVM, test setinin her vektörü için enfekte olmayan veya enfekte olmayan bir tahmin üretir.

Klinik örnekler ve etik bildirimi

University Health Network'ün PRESERVE Pandemic Response Biobank (UHN REB 20-5364 ve McGill IRB no. A03-M24-21B) aracılığıyla tükürük örnekleri aldık. 33 SARS-CoV-2 klinik örneği, ateş, yorgunluk ve kuru öksürük gibi COVID-19 semptomları olan yetişkin hastalardan toplandı. Tüm numunelerin kimlikleri çözüldü ve RT-PCR kullanılarak SARS-CoV-2 için pozitif olarak test edildi. Ayrıca viral yük, qPCR (QuantStudio 12K Flex, Thermo Fisher Scientific) ile değerlendirildi. QPCR primer dizileri Ek Tabloda verilmiştir. 13. Numuneler, Yahudi Genel Hastanesi'ndeki Lady Davis Enstitüsü'nde bulunan bir Seviye 2+ tesisinde değerlendirildi.

Elektrokimyasal ölçümler

Elektrokimyasal ölçümler, bir Autolab PGSTAT204 potansiyostat/galvanostat kullanılarak geleneksel bir üç elektrotlu hücrede gerçekleştirildi. Plazmonik platformlar çalışma elektrotu olarak kullanılırken, Ag/AgCl ve platin tel sırasıyla referans ve karşıt elektrotlar olarak görev yaptı. Döngüsel voltametri testlerinin potansiyeli, 1 mV s tarama hızına sahip referans elektroda kıyasla -1 ila 50 V arasında değişiyordu.^-1. Fototepkinin ölçümü, sulu bir nükleik asit amplifikasyon tahlil çözeltisinde (5 parça LAMP Master) 1 V'luk bir öngerilim potansiyelinde, kıyılmış ortam görünür ışığı (ışık açma-kapama döngüleri, 10 s) altında kronoamperometri tekniği kullanılarak yapıldı. Karışım, 2 kısım ×10 primer stoğu, 7 kısım RNaz içermeyen su ve 1 kısım hedef RNA numunesi).

tanımlama

Plazmonik platformlardaki optimizasyon çalışmaları için atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve SEM dahil olmak üzere fiziksel karakterizasyon teknikleri kullanıldı. AFM, Bruker MultiMode8 ekipmanı ile gerçekleştirilirken, SEM, bir FEI Quanta 450 çevresel taramalı elektron mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Optik karakterizasyonlar, 750 nm'den 60 nm'ye kadar 200 dakikalık amplifikasyon sırasında beyaz ışık absorpsiyon ölçümlerinin toplandığı Lambda850 yakın kızılötesi-UV-görünür ekipman aracılığıyla gerçekleştirildi. Çalışma ortamı, gelen ve toplanan ışık huzmelerinin platforma normal gelişinin olduğu platformda zaman noktası çözümlerinin birikimini içermektedir. Platformun temel elektrik alan dağılımı, sonlu fark zaman alanı modülü (v.8.21.1781, Lumerical Solutions) kullanılarak incelenmiştir. Mikroakışkan kartuşun temel sıvı akışı ve ısı transferi özellikleri COMSOL Multiphysics (v.5.6) kullanılarak incelenmiştir.

istatistiksel analiz

Sonuçlar, görüntü işleme bölümünde açıklandığı gibi, üçlü ölçümler için ortalama değer ± standart hata olarak verilir. İstatistiksel analiz için OriginPro (OriginLab, 2021) yazılım paketi kullanılmıştır. Saptama sınırları ve doğrusal aralıklar, çizgi eğimi ve kesişmenin standart hatası dahil olmak üzere doğrusal regresyon yöntemleri kullanılarak hesaplandı. İstatistiksel anlamlılık, ortalama karşılaştırma için post hoc Tukey testi ile tek yönlü bir varyans analizi (ANOVA) kullanılarak değerlendirildi. Veri seti farkı, istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. P < 0.001. Eşleştirilmiş Karşılaştırma Plot (v.3.60, OriginLab) grafik uygulaması, muhafazakar kullanarak rakamları oluşturmak için kullanıldı. P değerleri.

Raporlama özeti

Araştırma tasarımı hakkında daha fazla bilgi Doğa Portföyü Raporlama Özeti bu makaleye bağlantılı.

• SEO Destekli İçerik ve Halkla İlişkiler Dağıtımı. Bugün Gücünüzü Artırın.
• PlatoAiStream. Web3 Veri Zekası. Bilgi Genişletildi. Buradan Erişin.
• Adryenn Ashley ile Geleceği Basmak. Buradan Erişin.
• PREIPO® ile PRE-IPO Şirketlerinde Hisse Al ve Sat. Buradan Erişin.
• Kaynak: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01384-5