ไมโครอิเล็กโทรดแบบฟิล์มบางที่ใช้กราฟีนที่มีรูพรุนนาโนสำหรับการบันทึกและการกระตุ้นระบบประสาทที่มีความละเอียดสูงในสิ่งมีชีวิต - นาโนเทคโนโลยีธรรมชาติ

การเตรียมวัสดุและการกำหนดลักษณะเฉพาะ

สารละลาย GO ที่เป็นน้ำถูกเจือจางในน้ำปราศจากไอออนเพื่อให้ได้ 0.15 มก. มล.^-1 สารละลายและสุญญากาศถูกกรองผ่านเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสที่มีรูพรุนขนาด 0.025 µm ทำให้เกิดเป็นฟิล์มบางของ GO จากนั้น ฟิล์มบางถูกถ่ายโอนไปยังซับสเตรตเป้าหมายโดยใช้การถ่ายโอนแบบเปียกในน้ำปราศจากไอออนและการอบอ่อนด้วยความร้อนเพิ่มเติมที่ 100 °C เป็นเวลา 2 นาที ชั้นฟิล์ม–สารตั้งต้น GO ถูกลดความร้อนด้วยความร้อนที่ 134 °C ในหม้อนึ่งความดันมาตรฐานเป็นเวลา 3  ชั่วโมงเพื่อสร้าง EGNITE สารตั้งต้นพื้นฐานสำหรับการศึกษาลักษณะเฉพาะทั้งหมดของ EGNITE เป็นรูปสี่เหลี่ยมจัตุรัส (1 × 1 ซม.²) ของ Si/SiO₂ (400 ไมโครเมตร/1 ไมโครเมตร)

XPS

การวัด XPS ดำเนินการด้วยเครื่องวิเคราะห์ Phoibos 150 (SPECS) ในสภาวะสุญญากาศสูงเป็นพิเศษ (ความดันพื้นฐาน 5 × 10^-10 mbar) ด้วยแหล่งกำเนิดรังสีเอกซ์ Al Kα แบบเอกรงค์ (1,486.74 eV) สเปกตรัมภาพรวมได้มาด้วยพลังงานการส่งผ่าน 50 eV และขนาดขั้น 1 eV และสเปกตรัมความละเอียดสูงได้มาด้วยพลังงานการส่งผ่าน 20 eV และขนาดขั้น 0.05 eV ความละเอียดโดยรวมในเงื่อนไขสุดท้ายเหล่านั้นคือ 0.58 eV ตามที่กำหนดโดยการวัดความกว้างเต็มที่ครึ่งหนึ่งของ Ag 3d5/2 จุดสูงสุดของเงินสปัตเตอร์ การวิเคราะห์ XPS แสดงให้เห็นการลดลงอย่างมากหลังการบำบัดด้วยความร้อนของจุดสูงสุดของ C–O (เกี่ยวข้องกับหมู่อีพอกไซด์) แต่มีส่วนช่วยเล็กน้อยของ C–OH, C=O และ C(O)OH เนื่องจากไฮดรอกซิล คาร์บอนิล และคาร์บอกซิลที่ คงอยู่หลังจากการลดลง การสลายตัวของ O1s พีคยืนยันพฤติกรรมดังกล่าว การสนับสนุนหลักให้กับ C1s อย่างไรก็ตามสัญญาณหลังจากการลดความร้อนใต้พิภพมาจาก sp² ออร์บิทัล C-C ไฮบริด^34,57.

การเลี้ยวเบนรังสีเอกซ์

การวัดการเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์ (θ-2θ สแกน) ดำเนินการในเครื่องวัดการเลี้ยวเบนของการวิจัยวัสดุ (Malvern PANalytical) เครื่องวัดการเลี้ยวเบนนี้มีแนวนอน ω-2θ โกนิโอมิเตอร์ (รัศมี 320  มม.) ในเรขาคณิตสี่วงกลม และทำงานร่วมกับหลอดเอ็กซ์เรย์เซรามิกที่มีขั้วบวก Cu Kα (λ = 1.540598 Å). เครื่องตรวจจับที่ใช้คือ Pixelcel ซึ่งเป็นเครื่องตรวจจับรังสีเอกซ์ที่รวดเร็วซึ่งใช้เทคโนโลยี Medipix2

รามัน สเปกโทรสโกปี

การวัดรามานสเปกโทรสโกปีดำเนินการโดยใช้สเปกโตรกราฟ Witec ที่ติดตั้งเส้นกระตุ้นด้วยเลเซอร์ 488 nm สำหรับการวัดนั้น Raman spectra ได้มาจากการใช้วัตถุประสงค์ 50 × และ 600 ร่องต่อตะแกรงนาโนเมตร กำลังเลเซอร์ถูกเก็บไว้ต่ำกว่า 1.5 mW เพื่อหลีกเลี่ยงการให้ความร้อนกับตัวอย่าง

TEM

ลาเมลลาลำแสงไอออนแบบโฟกัสถูกเตรียมด้วย Helios NanoLab DualBeam (LMA-INA) สำหรับการศึกษาภาคตัดขวางของตัวอย่าง EGNITE การวิเคราะห์โครงสร้างดำเนินการโดยใช้ TEM โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Tecnai F20 ทำงานที่ 200 kV รวมถึง HRTEM และเทคนิค STEM สนามมืดวงแหวนมุมสูง การทดลอง STEM-EELS ดำเนินการในกล้องจุลทรรศน์ Tecnai F20 ซึ่งทำงานที่ 200 KeV โดยมีรูรับแสง 5  มม. ความยาวกล้อง 30  มม. มุมลู่เข้า 12.7 mrad และมุมรวม 87.6 mrad เนื่องจากเราใช้ 0.5 eV ต่อพิกเซลและ 250 eV เป็นพลังงานเริ่มต้นในการได้มาซึ่งการสูญเสียคอร์ เราจึงไม่ได้รับ Si K-edge ที่คาดหวังที่ 1,839 eV, Pt M-edge ที่ 2,122 eV และ Au M-edge ที่ 2,206 eV. องค์ประกอบอะตอมของ C–O สัมพัทธ์ได้มาโดยการมุ่งความสนใจไปที่เลเยอร์ GO ที่ลดลง และสมมติว่าขอบที่วิเคราะห์ (C และ O ในกรณีของเรา) รวมเป็น 100% สมมติฐานนี้ใช้ได้ในกรณีของเราตามหลักฐานใน ข้อมูลเสริม แผนที่ ภาพตัดขวางส่วนต่างพลังงานคำนวณโดยใช้แบบจำลอง Hartree–Slater และพื้นหลังโดยใช้แบบจำลองกำลังต่ำ

การนำไฟฟ้า

การวัดค่าการนำไฟฟ้าดำเนินการโดยใช้เครื่องวัดแหล่งที่มา Keithley 2400 ในรูปแบบสองจุด ตัวอย่างที่วัดได้ประกอบด้วยฟิล์ม EGNITE ขนาด 1 × 1 ซม² ด้านบนของ SiO₂ สารตั้งต้น

การวิเคราะห์ข้อมูล

การเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์ ข้อมูล Raman และ XPS ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้แพ็คเกจ Python 3.7 (Numpy, Pandas, Scipy, Xrdtools, Lmfit, Rampy, Peakutils, Matplotlib) ระยะห่างระหว่างระนาบคำนวณจากการวัดการเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์ตามกฎของสเนลล์ เมื่อข้อมูลถูกย้ายไปยังโดเมนเชิงพื้นที่แล้ว ยอดสูงสุดของพีคก็จะถูกพอดี ระยะทางที่สอดคล้องกันให้ค่าเฉลี่ยของระยะห่างระหว่างระนาบ การเบี่ยงเบนจากค่าเฉลี่ยเหล่านั้นคำนวณจากความกว้างเต็มที่ครึ่งหนึ่งสูงสุดของอุปกรณ์ฟิตติ้งลอเรนเซียนของยอดเขาบนโดเมนเชิงพื้นที่ การวัดค่า XPS และรามานสเปกโทรสโกปีได้รับการวิเคราะห์โดยปรับการโคจรของพีคในตำแหน่งที่คาดไว้สำหรับลักษณะเฉพาะที่สอดคล้องกัน ค่าการนำไฟฟ้าของ GO และ EGNITE ได้มาจากการปรับ I-V เส้นโค้งที่วัดได้ในการวัดค่าการนำไฟฟ้าตามกฎของโอห์ม ข้อมูลอยู่ n = 1 สำหรับการวัดแต่ละครั้ง

การสร้างอาร์เรย์ที่ยืดหยุ่น

การประดิษฐ์อุปกรณ์แสดงไว้ในรูปที่ 2 เพิ่มเติม 4. อุปกรณ์ถูกสร้างขึ้นบน Si/SiO ขนาด 4  นิ้ว₂ (400 μm/1 μm) เวเฟอร์ ขั้นแรก PI (PI-10, HD MicroSystems) ชั้นหนา 2611 µm ถูกเคลือบแบบหมุนบนเวเฟอร์และอบในบรรยากาศที่อุดมไปด้วยไนโตรเจนที่อุณหภูมิ 350 °C เป็นเวลา 30  นาที ร่องรอยของโลหะถูกสร้างลวดลายโดยใช้การพิมพ์หินด้วยแสงของโฟโตรีซิสต์แบบกลับภาพ (AZ5214, ไมโครเคมีคอล) การระเหยของลำอิเล็กตรอนถูกใช้เพื่อสะสมไทเทเนียม 20 nm และทองคำ 200 ทอง และทำการยกออก เราใช้ฟิล์ม EGNITE ที่มีความหนาประมาณ 1 μm เพื่อแลกกันระหว่างประสิทธิภาพทางเคมีไฟฟ้าและความยืดหยุ่นของอาร์เรย์ หลังจากถ่ายโอนฟิล์ม GO แล้ว อะลูมิเนียมจะถูกระเหยออกไป และพื้นที่ด้านบนของไมโครอิเล็กโทรดในอนาคตถูกกำหนดโดยใช้โฟโตรีซิสต์เชิงลบ (nLOF 2070, ไมโครเคมีคอล) แล้วยกออก ถัดไป ฟิล์ม GO ถูกสลักทุกที่ ยกเว้นไมโครอิเล็กโทรดในอนาคตโดยใช้การกัดไอออนปฏิกิริยาออกซิเจน (RIE) เป็นเวลา 5  นาที ที่ 500 W และคอลัมน์อะลูมิเนียมที่ป้องกันถูกสลักด้วยสารละลายเจือจางของกรดฟอสฟอริกและกรดไนตริก จากนั้น PI-3 ชั้นหนา 2611 µm ก็ถูกวางลงบนเวเฟอร์และอบตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า จากนั้นจึงกำหนดช่องเปิดของ PI-2611 บนไมโครอิเล็กโทรดโดยใช้โฟโตรีซิสต์แบบหนาเชิงบวก (AZ9260, ไมโครเคมีคอล) ซึ่งทำหน้าที่เป็นหน้ากากสำหรับออกซิเจน RIE ในเวลาต่อมา ต่อมา อุปกรณ์ถูกสร้างลวดลายบนเลเยอร์ PI อีกครั้งโดยใช้โฟโตรีซิสต์ AZ9260 และ RIE จากนั้นชั้นโฟโตรีซิสจะถูกกำจัดออกในอะซิโตน และเวเฟอร์จะถูกทำความสะอาดด้วยไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์และทำให้แห้ง ในที่สุด อุปกรณ์ก็ถูกลอกออกจากแผ่นเวเฟอร์และพร้อมที่จะใส่ในถุงฆ่าเชื้อที่จะบำบัดด้วยความร้อนที่อุณหภูมิ 134 °C ในหม้อนึ่งความดันมาตรฐานเป็นเวลา 3  ชั่วโมง

ลักษณะเฉพาะทางเคมีไฟฟ้าของไมโครอิเล็กโทรด

การแสดงคุณลักษณะทางเคมีไฟฟ้าของไมโครอิเล็กโทรดดำเนินการด้วยโพเทนชิโอสแตต Metrohm Autolab PGSTAT128N ใน 1× PBS (Sigma-Aldrich, P4417) ที่ประกอบด้วยบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 10 mM NaCl 137 mM NaCl และ 2.7 mM KCl ที่ pH 7.4 และใช้การกำหนดค่าแบบสามอิเล็กโทรด อิเล็กโทรด Ag/AgCl (FlexRef, WPI) ถูกใช้เป็นข้อมูลอ้างอิง และใช้ลวดแพลตตินัม (Alfa Aesar, 45093) เป็นอิเล็กโทรดเคาน์เตอร์

ก่อนการประเมินประสิทธิภาพ อิเล็กโทรดถูกพัลส์ด้วยพัลส์ที่สมดุลประจุ 10,000 พัลส์ (1 ms, 15 µA) การที่อิเล็กโทรดสัมผัสกับโปรโตคอลการเต้นเป็นจังหวะต่อเนื่องที่ดำเนินการโดย 100 รอบโวลแทมเมทรีแบบไซคลิก (−0.9 ถึง +0.8 V) ที่ 50 mV s^-1, 20 ครั้งด้วยพัลส์ 5,000 ครั้ง (1 ms) และการกำหนดศักย์ไฟฟ้าของวงจรเปิดใหม่

การวิเคราะห์ข้อมูล

ข้อมูลลักษณะทางเคมีไฟฟ้าได้รับการวิเคราะห์โดยใช้แพ็คเกจ Python 3.7 (Numpy, Pandas, Scipy, Pyeis, Lmfit, Matplotlib) ข้อมูลอิมพีแดนซ์สเปกโทรสโกปีถูกติดตั้งเข้ากับแบบจำลองทางไฟฟ้าที่เทียบเท่ากันซึ่งประกอบด้วยความต้านทาน (R) อนุกรมกับองค์ประกอบเฟสคงที่ (CPE) จากนั้น ค่า CPE จะถูกประมาณค่าความจุและหารด้วยพื้นที่เรขาคณิตของไมโครอิเล็กโทรด เพื่อให้ได้ค่าที่เท่ากันสำหรับความจุระหว่างพื้นผิวของ EGNITE ความจุการเก็บประจุของอิเล็กโทรดไมโครอิเล็กโทรด (CSC) คำนวณจากการวัดโวลแทมเมทรีแบบวนโดยการบูรณาการระบบแคโทดและขั้วบวกของกระแสที่วัดได้และทำให้เป็นมาตรฐานด้วยอัตราการสแกน ความจุการจัดเก็บประจุแคโทดและขั้วบวก (cCSC และ aCSC) ที่อัตราการสแกน 100 mV ของ EGNITE คือ 45.9 ± 2.4 และ 34.6 ± 2.8 mC cm^-2ตามลำดับ (n = 3). ตามที่รายงานสำหรับวัสดุอื่น ๆ⁵⁸CSC ที่ได้รับขึ้นอยู่กับอัตราการสแกน (รูปที่เสริม 5). เพื่อประเมินการมีอยู่ของปฏิกิริยาการลดออกซิเจน เราได้วัดรูปคลื่น CV ภายใต้อิเล็กโทรไลต์ที่กำจัดไนโตรเจน⁵⁹ และไม่สังเกตเห็นความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในรูปคลื่น (รูปที่ 2 เพิ่มเติม) 6). อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์ของเราไม่ได้ระบุถึงผลกระทบของปฏิกิริยาการลดออกซิเจนต่อความสามารถในการฉีดประจุของ EGNITE ได้อย่างสมบูรณ์ และจำเป็นต้องทำงานเพิ่มเติมเพื่อตรวจสอบเรื่องนี้อย่างเหมาะสม ความสามารถในการฉีดประจุของไมโครอิเล็กโทรด (CIC) ถูกกำหนดโดยการกำหนดแอมพลิจูดของพัลส์ปัจจุบันที่ทำให้เกิดแรงดันไฟฟ้าที่แตกต่างกัน (หลังจากเอาการตกของโอห์มมิกออกแล้ว) ที่ตรงกับหน้าต่างน้ำเคมีไฟฟ้าของอิเล็กโทรด (−0.9 V สำหรับแคโทดและ +0.8 V สำหรับขั้วบวกเทียบกับ Ag/AgCl ) (รูปที่เสริม 17)⁶⁰.

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลมีค่าเฉลี่ย ± s.d. n = 18 สำหรับ EIS และ n = 3 สำหรับโครโนโพเทนชิโอมิเตอร์ ข้อมูลของแผนที่การเคลื่อนที่ของแรงดันไฟฟ้าแบบคาโทดิกคือค่าเฉลี่ยของการเคลื่อนที่ของแรงดันไฟฟ้าแบบคาโธดิกสำหรับเหตุการณ์หนึ่งสำหรับรูปร่างพัลส์แต่ละรูปของ n = 3 อิเล็กโทรด

การประเมินเสถียรภาพทางกล

อัลตราซาวนด์ sonication

อาร์เรย์อิเล็กโทรด EGNITE ถูกวางไว้ในบีกเกอร์ที่เต็มไปด้วยน้ำในอ่างน้ำอัลตราซาวนด์ (Elmasonic P 180H) Sonication ถูกนำมาใช้ที่ 37 kHz เป็นเวลา 15 min ที่ 200 W และตามด้วยเสียง Sonication เพิ่มเติมอีก 15 min ที่ 37 kHz โดยมีกำลังเพิ่มขึ้นเป็น 300 W ภาพอิเล็กโทรดได้รับมาก่อนและหลังขั้นตอนการ Sonication

การทดสอบการดัด

การตั้งค่าการดัดงอ (รูปที่. 2k) ประกอบด้วยแท่งทรงกระบอกสามแท่ง ส่วนตรงกลาง (เส้นผ่านศูนย์กลาง 700 µm) ถูกลดระดับลง ทำให้มีมุมโค้งงอ 131° มีการใช้อาร์เรย์ไมโครอิเล็กโทรดแบบยืดหยุ่นสามตัวสำหรับการทดสอบการดัดงอ แต่ละอาร์เรย์มีไมโครอิเล็กโทรด 18 ตัวที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 50 µm มีการวัดอาเรย์สองชุดหลังจาก 10 และ 20 รอบ ในขณะที่อุปกรณ์หนึ่งวัดเพียง 10 รอบเท่านั้น เนื่องจากได้รับความเสียหายระหว่างการจัดการหลังการวัด รอบการทดสอบการดัดงอประกอบด้วยการใช้งานโหลดนาน 10 วินาทีบวก 10  วินาทีโดยไม่มีโหลด อุปกรณ์มีลักษณะเฉพาะทางเคมีไฟฟ้า (EIS และ CV) ก่อนและหลังรอบการดัดงอ 10 และ 20 รอบ

การบันทึกประสาทแบบ Epicortical

การฝังแบบ Epicortical

ขั้นตอนการทดลองทั้งหมดได้ดำเนินการตามคำแนะนำของสภาประชาคมยุโรปและกฎหมายของฝรั่งเศสสำหรับการดูแลและการใช้สัตว์ทดลอง ระเบียบการได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมเกรอน็อบล์ (ComEth) และได้รับอนุญาตจากกระทรวงฝรั่งเศส (หมายเลข 04815.02) หนู Sprague–Dawley (ตัวผู้ อายุ 4  เดือน ชั่งน้ำหนัก -600 ไมโครกรัม) ถูกดมยาสลบในกล้ามเนื้อด้วยคีตามีน (50 ไมโครกรัมต่อกิโลกรัม (น้ำหนักตัว)) และไซลาซีน (10 ไมโครกรัมต่อกิโลกรัม (น้ำหนักตัว)) และจากนั้นจับจ้องไปที่ตัวยึดสเตอริโอแท็กซี่ การถอดกะโหลกศีรษะขมับออกจะเผยให้เห็นเปลือกสมองส่วนการได้ยิน Dura mater ถูกเก็บรักษาไว้เพื่อหลีกเลี่ยงความเสียหายต่อเนื้อเยื่อเยื่อหุ้มสมอง มีการเจาะรูที่จุดยอดเพื่อใส่อิเล็กโทรดอ้างอิง และเจาะรูที่สอง 7  มม. ไปทางด้านหน้าจากรูแรกเพื่อใส่อิเล็กโทรดกราวด์ อิเล็กโทรดเป็นพินหนา 0.5 มม. ใช้สำหรับช่องเสียบวงจรรวม พวกเขาถูกวางไว้เพื่อสัมผัสทางไฟฟ้ากับดูราเมเตอร์และยึดเข้ากับกะโหลกศีรษะด้วยซีเมนต์ทันตกรรม จากนั้นเราติดริบบิ้นไมโครอิเล็กโทรดพื้นผิวบนเปลือกการได้ยินดังแสดงในรูปที่ XNUMX 3b. รูปแบบของหลอดเลือดดำระบุเยื่อหุ้มสมองการได้ยินในพื้นที่ 41 ของแผนที่สมองหนูของ Krieg สัญญาณเยื่อหุ้มสมองถูกขยายไปพร้อมกันด้วยอัตราขยาย 1,000 และแปลงเป็นดิจิทัลที่อัตราการสุ่มตัวอย่าง 33 kHz ลำโพงขนาด 20  ซม. ที่อยู่ด้านหน้าหูของหนู ซึ่งอยู่ตรงข้ามกับเยื่อหุ้มสมองที่โผล่ออกมา ทำหน้าที่กระตุ้นทางเสียง สิ่งเร้าที่ส่งไปได้รับการตรวจสอบโดยไมโครโฟนขนาด 0.25 นิ้ว (Brüel & Kjaer, 4939) วางไว้ใกล้หูและนำเสนอในระดับความดันเสียง (dB SPL re 20 μPa) เราตรวจสอบการตอบสนองเวลาแฝงกลางจุดยอดบวก (ลบขึ้น) เกิดขึ้นโดยการคลิกที่สลับกันที่ 80 dB SPL และสิ่งเร้าระเบิดโทนเสียงที่ 70 dB SPL ด้วยความถี่ตั้งแต่ 5 ถึง 40 kHz เวลาขึ้นและลงที่ 5 ms และ ระยะเวลา 200 ms

การวิเคราะห์ข้อมูล

ข้อมูลทางไฟฟ้าสรีรวิทยาได้รับการวิเคราะห์โดยใช้แพ็คเกจ Python 3.7 (Numpy, Pandas, Scipy, Neo, Elephant, Sklearn Matplotlib) และไลบรารีที่กำหนดเอง PhyREC (https://github.com/aguimera/PhyREC). rms ค่าถูกคำนวณด้วยหน้าต่างเลื่อน 20 ms ที่ความถี่สูงกว่า 200 Hz สเปกโตรแกรมถูกคำนวณสำหรับช่วงระหว่าง 70 Hz และ 1.1 kHz PSD ได้รับการคำนวณมากกว่า 60 s ของการบันทึกต่อเนื่อง สำหรับอาร์เรย์อิเล็กโทรดที่กำหนด จะมีการคำนวณ PSD สองตัว: ในสิ่งมีชีวิต (IV) และหลังชันสูตร (PM) SNR แสดงเป็น dB (20 × ln(r.m.s.(IV)/r.m.s.(PM))) และประมาณค่า 20 จุด โดยเว้นระยะห่างแบบลอการิทึมระหว่าง 10 Hz และ 1 kHz

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลประสาท Epicortical แสดงในรูปที่ 1 3 นำมาจากการวัดแต่ละตัวในสัตว์ตัวเดียว ในรูป 3cนำเสนอข้อมูลจากอิเล็กโทรด 64 อิเล็กโทรด ในรูป 3dข้อมูลจากอิเล็กโทรดที่เลือกสองอันจะถูกนำเสนอ ในรูป 3f, PSD และ SNR คำนวณจากอิเล็กโทรด EGNITE 64 อิเล็กโทรด และแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± s.d ในรูปเสริม 12ค,ง ข้อมูลค่ามัธยฐานจะถูกนำเสนอสำหรับอิเล็กโทรด EGNITE 192 อิเล็กโทรดจาก n = 3 การทดลองและอิเล็กโทรดแพลทินัม 60 อันจาก n = 1 การทดลอง

การบันทึกระบบประสาทภายใน

การฝังในเยื่อหุ้มสมอง

สัตว์ได้รับการดมยาสลบด้วยส่วนผสมของคีตามีน/ไซลาซีน (75:1, 0.35 มล./28 g ip.) และสถานะนี้ถูกรักษาไว้ด้วยหน้ากากสำหรับการสูดดมซึ่งมีไอโซฟลูเรน 1.5% ไมโครสกรูหลายตัวถูกใส่เข้าไปในกะโหลกศีรษะเพื่อรักษาความมั่นคงของการปลูกถ่าย และใช้ไมโครสกรูที่อยู่ด้านบนของสมองน้อยเป็นพื้นดินทั่วไป โพรบถูกฝังในเยื่อหุ้มสมองส่วนหน้า (พิกัด: AP, 1.5 mm; ML, ±0.5 mm; DV, −1.7 mm จาก bregma) การฝังดำเนินการโดยการเคลือบโพรบด้วยมอลโตส (ดูเกณฑ์วิธีด้านล่าง) เพื่อให้โพรบมีความแข็งชั่วคราวและอำนวยความสะดวกในการใส่โพรบ โพรบถูกปิดผนึกด้วยซีเมนต์ทันตกรรม ตัวเชื่อมต่อ TDT-ZifClip ใช้เพื่อเชื่อมต่อโพรบกับระบบไฟฟ้าสรีรวิทยาผ่านสายเคเบิลขนาดเล็ก หลังการผ่าตัด หนูจะพักฟื้นเป็นเวลา 1  สัปดาห์ โดยได้รับการรักษาด้วยยาแก้ปวด (บูพรีนอร์ฟีน) และยาแก้อักเสบ (มีลอกซิแคม) กิจกรรมของระบบประสาทถูกบันทึกด้วยระบบ Open Ephys หลายช่องสัญญาณที่อัตราการสุ่มตัวอย่าง 30 kHz ด้วยเครื่องขยายสัญญาณ Intan RHD2132 การทดลองงานด้านการได้ยินดำเนินการในกล่องกันเสียง โดยมีวิทยากรสองคนอยู่ข้างในโดยใช้โปรโตคอลตามงานที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้⁶¹. การกระตุ้นด้วยเสียงประกอบด้วยการคลิกเสียงสีขาวยาว 15 มิลลิวินาที ทำซ้ำ 100 ครั้ง (รอบ) โดยแต่ละครั้งคั่นด้วย 5 s (ช่วงระหว่างการกระตุ้น) ในระหว่างภารกิจ สัตว์สามารถเคลื่อนไหวได้อย่างอิสระ

โปรโตคอลการทำให้แข็งตัวของมอลโตส

สารละลายมอลโตสที่เป็นน้ำจะถูกให้ความร้อนจนถึงจุดเปลี่ยนสถานะคล้ายแก้ว (T_g) ระหว่าง 130 ถึง 160 °C โดยใช้จานร้อนหรือไมโครเวฟ เมื่อมอลโตสมีความหนืด ด้านหลังของโพรบจะสัมผัสกับมอลโตสเท่านั้น เมื่อมอลโตสเย็นลง โพรบจะแข็งตัวและทำให้แข็งขึ้น

การวิเคราะห์ข้อมูล

สัญญาณประสาทจากอิเล็กโทรดแต่ละตัวถูกกรองแบบออฟไลน์เพื่อแยก SUA และ LFP SUA ถูกประเมินโดยการกรองสัญญาณระหว่าง 450 ถึง 6,000 Hz และเดือยจากเซลล์ประสาทแต่ละตัวถูกจัดเรียงโดยใช้การวิเคราะห์องค์ประกอบหลักด้วย Offline Sorter v.4 (Plexon) ในการรับ LFP สัญญาณจะถูกลดขนาดลงเป็น 1 kHz, ลดแนวโน้มและกรองรอยบากเพื่อลบสิ่งรบกวนของเส้นสัญญาณรบกวน (50 Hz และฮาร์โมนิกของมัน) ด้วยสคริปต์ที่เขียนแบบกำหนดเองใน Python AEP SNR คำนวณเป็นอัตราส่วนของแอมพลิจูด N1 สูงสุดและ sd ในช่วงเวลา 20  ms ก่อนเกิดการกระตุ้น

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลที่แสดงในรูปที่. 3 ชม. ฉัน มีค่าเฉลี่ย ± s.d. n = 30 คือจำนวนการทดลองโดยเฉลี่ย ข้อมูลที่บันทึกจากอิเล็กโทรดเดียวกันจะแสดงในวันที่ 30, 60 และ 90 ข้อมูลจากสัตว์ตัวเดียวจะถูกนำเสนอ

ความเข้ากันได้ทางชีวภาพของ Epicortical แบบเรื้อรัง

การฝังอุปกรณ์โดยการผ่าตัด

การศึกษานี้ใช้หนู Sprague – Dawley ผู้ใหญ่ เพศผู้ จำนวน 27 ตัว (แม่น้ำชาร์ลส์) สัตว์ถูกเลี้ยงไว้ที่อุณหภูมิแวดล้อม 21 ± 2 °C และความชื้น 40–50% บนวงจรมืด 12 h/12 h หนูถูกเลี้ยงเป็นกลุ่มและได้รับอาหารและน้ำฟรีตลอดระยะเวลาการทดลอง ขั้นตอนการทดลองดำเนินการตามกฎหมายสวัสดิภาพสัตว์ (1998) ภายใต้การอนุมัติของสำนักงานที่บ้านในสหราชอาณาจักรและหน่วยงานตรวจสอบจริยธรรมสวัสดิภาพสัตว์ในท้องถิ่น (AWERB) สัตว์ได้รับการดมยาสลบด้วยไอโซฟลูเรน (2–3%) ตลอดระยะเวลาของการผ่าตัด และความลึกของการดมยาสลบได้รับการตรวจสอบโดยการทดสอบแบบสะท้อนการบีบนิ้วเท้า สัตว์ถูกวางไว้ในโครง Stereotaxic (Kopf, 900LS) ซึ่งอยู่เหนือผ้าห่มระบายความร้อนเพื่อรักษาอุณหภูมิของร่างกาย หลุมเปิดกะโหลกศีรษะ (-5 มม. ×4 มม.) ถูกสร้างขึ้นให้ห่างจากเส้นกึ่งกลาง 1 มม. โดยใช้สว่านทันตกรรมที่มีดอกสว่านเสี้ยน 0.9 มม. ดูราถูกถอดออก และวางอุปกรณ์เอพิคอร์ติคอลบนพื้นผิวเยื่อหุ้มสมองของสมอง การผ่าตัดเปิดกะโหลกศีรษะปิดด้วยควิกซิล ตามด้วยซีเมนต์ทันตกรรมเพื่อยึด และเย็บปิดผิวหนัง ฉีดน้ำเกลือใต้ผิวหนัง (1 มล. ต่อกิโลกรัม (น้ำหนักตัว)) และบูพรีนอร์ฟีน (0.03 มก.ต่อกก. (น้ำหนักตัว)) เพื่อทดแทนของเหลวที่สูญเสียไปและลดความเจ็บปวดหลังการผ่าตัด และถอนการระงับความรู้สึก

การรวบรวมและการแปรรูปเนื้อเยื่อ

สัตว์ถูกยุติที่ 2, 6 หรือ 12 สัปดาห์หลังการปลูกถ่ายโดยวิธีการที่เหมาะสมสำหรับประเภทของการวิเคราะห์ที่จะดำเนินการ

มิญชวิทยาและอิมมูโนฮิสโตเคมี

ที่ 2, 6 หรือ 12 สัปดาห์ของหนูหลังการปลูกถ่ายถูกยกเลิกโดยกระแสเลือดไปเลี้ยงหัวใจด้วยเฮพารินไนซ์ (10 U มล.^-1, Sigma-Aldrich) PBS ตามด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% (PFA, Sigma-Aldrich) ใน PBS สมองถูกตรึงภายหลังใน 4% PFA เป็นเวลา 24 h จากนั้นจึงถ่ายโอนไปยังซูโครส 30% ใน PBS เป็นเวลาอย่างน้อย 48 h ก่อนที่จะแช่แข็งในไอโซเพนเทน จากนั้น สมองจะถูกเก็บไว้ที่ −80 °C จนกระทั่งถูกแช่แข็งที่ 25 µm จากนั้นเนื้อเยื่อจะถูกย้อมสำหรับอะแดปเตอร์จับแคลเซียมที่แตกตัวเป็นไอออนโมเลกุล 1 (Iba-1) เพื่อกำหนดระดับการกระตุ้นการทำงานของจุลชีพ โดยสรุป ส่วนเนื้อเยื่อถูกปิดกั้นด้วยซีรัมแพะ 5% ใน PBS ที่มีไทรทัน-X 0.1% เป็นเวลา 1  ชั่วโมงก่อนการฟักตัวข้ามคืนที่ 4 °C ด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิแอนติ-Iba-1 (1:1,000, 019-19741; Wako) จากนั้นส่วนต่างๆ ถูกย้อมด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิ, ต่อต้านกระต่าย Alexa Fluor 594 (1:400, A-11012; เทอร์โมฟิชเชอร์) เป็นเวลา 1  ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง สไลด์ถูกติดตั้งด้วยแผ่นปิดโดยใช้สื่อการติดตั้งป้องกันการเฟดของ Prolong Gold พร้อมด้วย 4,6-diamidino-2-phenylindole (เทอร์โม ฟิชเชอร์) โพรบครอบคลุมพื้นที่ 3 × 3.7 มม² บนพื้นผิวเยื่อหุ้มสมองของสมอง ส่วนเนื้อเยื่อที่เลือกสำหรับการย้อมสีครอบคลุมความยาว 3.2  มม. ของบริเวณนี้ สไลด์ถูกถ่ายภาพโดยใช้เครื่องสแกนสไลด์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ 3DHistech Pannoramic-250 ที่ 20× และวิเคราะห์ภาพโดยใช้ CaseViewer v.2.4 (3DHistech) เพื่อประเมินการกระตุ้นไมโครเกลีย พื้นที่ 3.2 มม. ถูกครอบคลุม โดยมีหนึ่งภาพวิเคราะห์ทุกๆ 100 µm ภาพถูกถ่ายโดยใช้กำลังขยาย 8.5 เท่า ซึ่งมีรายละเอียดส่วนของตำแหน่งหัวตรวจอีพิคอร์ติคอล ซึ่งอยู่ห่างจากเส้นกึ่งกลางของสมอง 3  มม. ครอบคลุมพื้นที่ใต้ตำแหน่งหัววัดโดยตรง

การประมวลผลภาพ

ข้อมูลกล้องจุลทรรศน์ได้รับการประมวลผลภาพโดยใช้อัลกอริธึมสำหรับการระบุลักษณะฟีโนไทป์ของ microglia (รูปที่ 2 เพิ่มเติม) 13). การกระตุ้นจุลินทรีย์ถูกวิเคราะห์โดยใช้ CellProfiler* แบบกำหนดเอง (Broad Institute, v.3.1.9 จาก https://cellprofiler.org/) ไปป์ไลน์ ประการแรก โมดูล EnhanceOrSuppressFeatures ถูกนำมาใช้เพื่อปรับปรุงโครงสร้างเส้นใย เช่น นิวไรต์ โดยการใช้วิธีเพิ่มประสิทธิภาพความเป็นท่อ จากรูปภาพที่ได้รับการปรับปรุง เซลล์ถูกแบ่งส่วนโดยใช้โมดูล IdentifyPrimaryObjects การวัดเบื้องต้นของเซลล์แนะนำว่าช่วงเส้นผ่านศูนย์กลางของวัตถุที่เหมาะสมคือ 3–40 พิกเซล วัตถุที่อยู่นอกช่วงเส้นผ่านศูนย์กลางนี้หรือสัมผัสขอบของภาพจะถูกทิ้งไป เซลล์ถูกแบ่งส่วนโดยใช้กลยุทธ์การกำหนดเกณฑ์แบบปรับตัวของ Otsu สองชั้นด้วยขนาดหน้าต่างแบบปรับได้ที่ 50 พิกเซล ออบเจ็กต์ที่ระบุโดยโมดูล IdentifyPrimaryObjects จะถูกป้อนเข้าสู่โมดูล MeasureObjectSizeShape เพื่อคำนวณคุณสมบัติที่จำเป็นสำหรับการจำแนกประเภทเซลล์ ในโมดูล ClassifyObjects หมวดหมู่ที่มีการระบุการจำแนกประเภทพื้นฐานให้เป็น AreaShape และเลือกขอบเขตเป็นการวัดที่สอดคล้องกัน เซลล์ถูกจัดประเภทเป็น 'เปิดใช้งาน' หรือ 'ไม่เปิดใช้งาน' ตามคุณสมบัติขอบเขต ซึ่งเป็นอัตราส่วนของพื้นที่ที่เซลล์ครอบครองต่อพื้นที่ที่ถูกครอบครองโดยกล่องขอบเขต วิธีการจำแนกประเภทนี้มีเหตุผลจากข้อเท็จจริงที่ว่า microglia ที่ถูกกระตุ้นนั้นมีเซลล์ขนาดใหญ่และไม่มีกระบวนการ ดังนั้นจึงใช้สัดส่วนของกรอบขอบเขตที่ใหญ่กว่ามากเมื่อเทียบกับเซลล์ที่ไม่ได้กระตุ้น สุดท้ายนี้ โมดูล CalculateMath และ ExportToSpreadsheet ถูกนำมาใช้ในการคำนวณและส่งออกสถิติที่ต้องการ

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ชุดข้อมูลได้แก่ n = 3 สำหรับอุปกรณ์แต่ละประเภท (การปลูกถ่าย PI เท่านั้น (PI); PI ที่มีทองคำที่ทำด้วยไมโครแฟบริเคทแบบเปลือย (ทองคำ) และ PI ที่มีทองคำที่ทำด้วยไมโครแฟบริเคทและ EGNITE (EGNITE) ตลอดเวลา) ยกเว้นทองคำที่ 6  สัปดาห์ซึ่งก็คือ n = 2 สำหรับข้อมูล ELISA ซีกโลกด้านตรงข้ามถูกรวมเข้าด้วยกันในแต่ละช่วงเวลาเพื่อให้ n = 9 ที่ 2 และ 12 สัปดาห์หลังการปลูกถ่าย และ n = 8 ที่ 6 สัปดาห์หลังการปลูกถ่าย การวิเคราะห์ข้อมูลเสร็จสิ้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism v.8 การวิเคราะห์ทางสถิติเสร็จสมบูรณ์โดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA) แบบสองทางด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบพหุคูณของ Tukey ตามความเหมาะสม P < 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญ

วิธี ELISA

หลังจากระยะเวลาการปลูกถ่าย สัตว์ถูกยุติโดยการเคลื่อนที่ของปากมดลูก เนื้อเยื่อสมองถูกสกัดจากสมองซีกขวาและซ้าย แช่แข็งในไนโตรเจนเหลว และเก็บไว้ที่ −80 °C จนกระทั่งนำไปใช้ต่อไป เนื้อเยื่อถูกสลายโดยใช้บัฟเฟอร์สลาย NP-40 (NaCl 150 mM, Tris-Cl 50 mM, สารทดแทน Nonidet P1 40%, Fluka, pH ปรับเป็น 7.4) ที่มีโปรตีเอสและตัวยับยั้งฟอสฟาเตส (ค็อกเทลตัวยับยั้งโปรตีเอสและฟอสฟาเตส, เทอร์โม ฟิชเชอร์) ตามด้วยการหยุดชะงักทางกลไกของเนื้อเยื่อ (TissueLyser LT, Qiagen) จากนั้นตัวอย่างถูกปั่นแยกเป็นเวลา 10 นาทีที่ 5,000 รอบต่อนาที และส่วนลอยเหนือตะกอนเก็บไว้ที่ 4 °C จนกระทั่งใช้งานต่อไป แผงการอักเสบของหนู LEGENDplex (หมายเลขแค็ตตาล็อก 740401, BioLegend) ซึ่งเป็นชุด ELISA แบบมัลติเพล็กซ์แบบบีดถูกดำเนินการเพื่อหาปริมาณไซโตไคน์ต่อไปนี้ IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-18, IL-33, CXCL1 (KC), CCL2 (MCP-1), แกรนูโลไซต์–การกระตุ้นอาณานิคมมาโครฟาจ ปัจจัย, อินเตอร์เฟอรอน-γ และปัจจัยเนื้อร้ายของเนื้องอก ชุดอุปกรณ์ดำเนินการตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยมีโปรตีนบรรจุอยู่ที่ปริมาตรคงที่ 15 µl หลังจากการบ่มด้วยส่วนลอยเหนือตะกอน เม็ดบีดถูกรันบนโฟลว์ไซโตมิเตอร์ BD FACSVerse และข้อมูลถูกวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์การวิเคราะห์ข้อมูล LEGENDplex

การกระตุ้นประสาท

การฝัง Intrafascicular

การทดลองกับสัตว์ทั้งหมดได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของ Universitat Autònoma de Barcelona ตามคำสั่งของ European Communities Council Directive 2010/63/EU สัตว์ถูกเลี้ยงไว้ที่อุณหภูมิ 22 ± 2 °C ภายใต้แสง 12 h/12 h รอบความมืด โดยมีอาหารและน้ำหาได้ฟรี เส้นประสาทไขสันหลังของหนู Sprague–Dawley ตัวเมียที่ถูกดมยาสลบ (250–300 g, -อายุ 18   สัปดาห์) ได้รับการผ่าตัด และอิเล็กโทรด TIME ถูกปลูกฝังตามขวางข้ามเส้นประสาทไซอาติกด้วยความช่วยเหลือของเข็มตรงที่ติดอยู่กับเกลียว 10-0⁴⁶. กระบวนการนี้ได้รับการตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบผ่าเพื่อให้แน่ใจว่าตำแหน่งที่ถูกต้องของตำแหน่งที่ออกฤทธิ์ภายในพังผืดเส้นประสาท (รูปที่. 4b). ในระหว่างการทดลอง อุณหภูมิร่างกายของสัตว์จะถูกรักษาไว้ด้วยแผ่นทำความร้อน

การกระตุ้นเส้นประสาทดำเนินการโดยการใช้ขบวนของพัลส์กระแสไฟฟ้าแบบไบเฟสซิกที่มีระยะเวลาคงที่ 100 µs ต่อเฟส และเพิ่มแอมพลิจูดจาก 0 ถึง 150 µA ในขั้น 1 หรือ 3 µA ที่ 3 Hz เป็นเวลา 33 s (เครื่องกระตุ้น DS4, Digitimer) ผ่าน EGNITE ที่แตกต่างกัน ไมโครอิเล็กโทรด พร้อมกัน CMAP ถูกบันทึกจากกล้ามเนื้อ GM, TA และ PL โดยใช้อิเล็กโทรดเข็มขนาดเล็ก (ยาว 13  มม., เส้นผ่านศูนย์กลาง 0.4  มม., อิเล็กโทรดเข็มสแตนเลส A-03-14BEP, ไบโอนิค) วางอยู่ในกล้ามเนื้อแต่ละอัน⁶². อิเล็กโทรดแบบแอคทีฟถูกวางไว้บนหน้าท้องของกล้ามเนื้อและอ้างอิงที่ระดับเอ็น การบันทึกด้วยไฟฟ้ากล้ามเนื้อถูกขยาย (×100 สำหรับ GM และ TA, ×1,000 สำหรับ PL; แอมพลิฟายเออร์ P511AC, หญ้า), กรองแบนด์พาส (3  Hz ถึง 3 kHz) และแปลงดิจิทัลด้วยระบบบันทึก PowerLab (PowerLab16SP, ADInstruments) ที่ 20  kHz

การวิเคราะห์ข้อมูล

แอมพลิจูดของแต่ละ CMAP วัดจากเส้นฐานถึงจุดสูงสุดที่เป็นลบสูงสุด การวัดค่าแรงดันไฟฟ้าสูงสุดถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็นแอมพลิจูด CMAP สูงสุดที่ได้รับสำหรับกล้ามเนื้อแต่ละมัดในการทดลอง ดัชนีการเลือก (SI) ถูกคำนวณสำหรับแต่ละตำแหน่งที่ทำงานเป็นอัตราส่วนระหว่างแอมพลิจูด CMAP ที่ทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับกล้ามเนื้อหนึ่งมัด CMAP_iและผลรวมของแอมพลิจูด CMAP ที่ทำให้เป็นมาตรฐานในกล้ามเนื้อทั้งสาม ตามสูตร SI_i = nWCPA_i/∑nWCPA_jที่แอมพลิจูดกระแสกระตุ้นขั้นต่ำที่กระตุ้นการตอบสนองของกล้ามเนื้อที่เกี่ยวข้องกับการทำงานขั้นต่ำ (กำหนดเป็นแอมพลิจูด CMAP อย่างน้อย 5% สำหรับหนึ่งในกล้ามเนื้อโดยคำนึงถึงแอมพลิจูด CMAP สูงสุดของกล้ามเนื้อนั้นที่ถูกกำหนดไว้ก่อนหน้านี้) จากนั้น ตำแหน่งที่มี SI สูงสุดสำหรับกล้ามเนื้อแต่ละมัดจากทั้งสามส่วนจะถูกเลือกเป็น SI สำหรับกล้ามเนื้อแต่ละมัดในการทดลองที่กำหนด

ความเข้ากันได้ทางชีวภาพภายในระบบประสาทแบบเรื้อรัง

ตามขั้นตอนที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้^50,63, เส้นประสาทไซอาติกของหนูเพศเมีย Sprague–Dawley ที่ได้รับการดมยาสลบ (250-300 g, -อายุ 18   สัปดาห์) ถูกเปิดเผยและอุปกรณ์สำหรับความเข้ากันได้ทางชีวภาพ ภายในร่างกาย ที่มีและไม่มี EGNITE ถูกปลูกฝังตามยาวในสาขากระดูกหน้าแข้งของเส้นประสาทไซแอติก (n = 6–8 ต่อกลุ่ม) โดยสรุป เส้นประสาทถูกเจาะที่ trifurcation โดยใช้เข็มตรงติดอยู่กับเกลียว 10-0 (STC-6, Ethicon) ด้ายจะดึงปลายรูปลูกศรของแถบอิเล็กโทรดที่โค้งงอ ปลายถูกตัดเพื่อดึงด้ายออก และปลายแขนแต่ละข้างงอเล็กน้อยเพื่อหลีกเลี่ยงการหลุดออกจากอุปกรณ์ เลือกใช้การปลูกถ่ายตามยาวเนื่องจากช่วยให้สามารถศึกษาการตอบสนองของร่างกายต่อสิ่งแปลกปลอมภายในเส้นประสาทได้ดีขึ้น⁵⁰.

การประเมินการทำงานของเส้นประสาทและสัตว์

สัตว์ได้รับการประเมินในระหว่างการติดตามผลหลังการปลูกถ่ายโดยวิธีการทดสอบการนำกระแสประสาท การวัดความสามารถในการวิเคราะห์และการเคลื่อนที่ของทางเดิน⁶². สำหรับการทดสอบการนำไฟฟ้า เส้นประสาทไซอาติกของอุ้งเท้าที่ฝังและอุ้งเท้าด้านตรงข้ามถูกกระตุ้นด้วยอิเล็กโทรดแบบเข็มที่รอยบากไซอาติก และ CMAP ของกล้ามเนื้อ PL ได้รับการบันทึกดังข้างต้น วัดเวลาแฝงและแอมพลิจูดของ CMAP สำหรับการทดสอบการวัดค่าความคลาดเคลื่อน หนูจะถูกวางบนแท่นที่มีตะแกรงลวด และใช้การกระตุ้นเชิงกลที่ไม่เป็นพิษกับปลายโลหะที่เชื่อมต่อกับเครื่องวัดความลึกแบบอิเล็กทรอนิกส์ Von Frey (Bioseb) เกณฑ์การรับความรู้สึกเจ็บปวด (แรงเป็นกรัมที่สัตว์ถอนอุ้งเท้า) ของอุ้งเท้าที่ปลูกถ่ายเทียบกับอุ้งเท้าด้านตรงข้ามถูกวัด สำหรับการทดสอบทางเดินเท้า พื้นผิวฝ่าเท้าของอุ้งเท้าหลังถูกทาด้วยหมึกสีดำ และปล่อยให้หนูแต่ละตัวเดินไปตามทางเดิน มีการรวบรวมรอยเท้าและคำนวณดัชนีการทำงานของไซแอติก⁶².

จุลกายวิภาคศาสตร์เนื้อเยื่อ

หลังจากผ่านไป 2 หรือ 8 สัปดาห์ สัตว์จะถูกรวมเข้ากับ PFA (4%) และเส้นประสาทไซแอติกถูกเก็บเกี่ยว หลังการตรึง เก็บรักษาด้วยการแช่แข็ง และประมวลผลสำหรับการวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อวิทยา สำหรับการประเมิน FBR เส้นประสาทไซแอติกถูกตัดในส่วนขวางที่มีความหนา 15 ไมโครเมตรด้วยเครื่องแช่แข็ง (Leica CM190) ตัวอย่างถูกย้อมด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิสำหรับแอกซอนไมอีลิน (แอนติ-RT97 เพื่อติดฉลาก NeuroFIlament 200K, 1:200; Developmental Studies Hybridoma Bank) และมาโครฟาจ (แอนติ-Iba-1, 1:500; Wako) จากนั้น ส่วนต่างๆ ถูกบ่มเป็นเวลา 1  ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ต้านหนูเมาส์ Alexa Fluor 488 และหนูที่ต้านกระต่าย Alexa Fluor 555 (1:200, Invitrogen) เลือกส่วนที่เป็นตัวแทนจากส่วนกลางของการปลูกถ่ายในเส้นประสาท tibial ภาพที่ถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์ epifluorescence (Eclipse Ni, Nikon) ที่ติดกับกล้องดิจิตอล (DS-Ri2, Nikon) และการวิเคราะห์ภาพที่ดำเนินการด้วยซอฟต์แวร์ ImageJ (สถาบันแห่งชาติ ด้านสุขภาพ) ปริมาณของเซลล์ที่เป็นบวก Iba-1 ในพื้นที่ทั้งหมดของเส้นประสาทหน้าแข้งถูกวัดปริมาณและวัดความหนาของแคปซูลเนื้อเยื่อเป็นระยะทางเฉลี่ยของแต่ละด้านของการปลูกถ่ายไปยังแอกซอนที่ใกล้ที่สุด

การวิเคราะห์ทางสถิติ

สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูลทางสถิติ เราใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวหรือสองทาง ตามด้วยการทดสอบหลังการทดสอบของ Bonferroni เพื่อดูความแตกต่างระหว่างกลุ่มหรือเวลา ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism ใช้สำหรับการแสดงและวิเคราะห์กราฟิก นัยสำคัญทางสถิติได้รับการพิจารณาเมื่อใด P <0.05.

สรุปการรายงาน

ข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับการออกแบบการวิจัยมีอยู่ใน สรุปการรายงานผลงาน Nature เชื่อมโยงกับบทความนี้

• เนื้อหาที่ขับเคลื่อนด้วย SEO และการเผยแพร่ประชาสัมพันธ์ รับการขยายวันนี้
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai เพิ่มพลังให้กับตัวเอง เข้าถึงได้ที่นี่.
• เพลโตไอสตรีม. Web3 อัจฉริยะ ขยายความรู้ เข้าถึงได้ที่นี่.
• เพลโตESG. คาร์บอน, คลีนเทค, พลังงาน, สิ่งแวดล้อม แสงอาทิตย์, การจัดการของเสีย. เข้าถึงได้ที่นี่.
• เพลโตสุขภาพ เทคโนโลยีชีวภาพและข่าวกรองการทดลองทางคลินิก เข้าถึงได้ที่นี่.
• ที่มา: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01570-5