Izotermna samosestava večkomponentnih in evolutivnih nanostruktur DNA - Naravna nanotehnologija

Ponovno objavil Platon

Spremljevalci: 0

inkubacijska

Vsi inkubacijski postopki so bili izvedeni v ThermoMixer C (Eppendorf), razen za dodatne slike. 1 in 9 (Inkubator Dry Bath FB15103, Fisher Scientific) in za sl. 1c in dopolnilne fige. 3-6 (QuantStudio5, Applied Biosystems podjetja Thermo Fisher Scientific).

Izotermna samosestava 2D DNA origamisa

Glej sl. 1 in dopolnilne fige. 1-9 in 11-14. Uporabili smo koktajl s sponkami brez kakršne koli toplotne predobdelave in ga neposredno zmešali z želenim pufrom pred kratkim vrtinčenjem in dodajanjem predloge M13 (1 nM) raztopini ter nežnim mešanjem navzgor in navzdol s pipeto. Raztopino smo pustili inkubirati brez nadaljnjega mešanja pri fiksni temperaturi želeno količino časa.

Toplotno žarjenje origami DNA v pufru TANa

Glejte dodatno sliko. 10. Sestavili smo šablono M13 (1 nM) z mešanico sponk (40 nM vsaka sponka) v TANa, dopolnjenem s 100 mM NaCl. Vzorec smo inkubirali 10 minut pri 90 °C in nato izpostavili termični rampi v peqSTAR 2X termociklerju (Peqlab) od 70 °C do 20 °C s hitrostjo -1 °C na 10 minut.

Čiščenje z obarjanjem PEG

Glejte dodatne slike. 13 in 14. Origami DNA, pridobljeni z izotermnim sestavljanjem v pufru TANa ([NaCl] = 100 mM) pri 25 °C, so bili očiščeni iz njihovih spenjanih pramenov z obarjanjem s PEG. Metoda je bila navdihnjena s protokolom, predstavljenim v prejšnjem poročilu³⁵. Origami DNA smo trikrat razredčili z raztopino PEG 8000 in NaCl, da smo dosegli končne koncentracije 4 % w/v oziroma 500 mM. Po nežnem mešanju smo raztopino pustili inkubirati 15 minut pri sobni temperaturi in centrifugirali pri 15,000g za 15 min. Supernatant smo odstranili in origami resuspendirali na začetni volumen v pufru TANa ([NaCl] = 100 mM). Po potrebi smo postopek ponovili za drugo zaporedno čiščenje.

Gel elektroforeza očiščenega origamisa

Glejte dodatno sliko. 13. Pripravili smo 50 ml agaroznega (tip I nizek EEO, Sigma Aldrich) 1.5 % gela, ki je vseboval 4 μl GR-Green 10,000× (Excellgen) v pufru TBE 1×. Ko se je gel ohladil, smo v vsako vdolbinico vnesli 18 µl 100 bp DNA Ladder (New England Biolabs) ali 18 µl vzorca, dopolnjenega z 1× raztopino SDS za nalaganje DNA barvila (Thermo Scientific). Migracija je bila izvedena pri 100 V 1 uro v 7 cm celici za elektroforezo, napolnjeni s pufrom TBE 1 ×.

Izotermna stopenjska montaža

Glejte dodatno sliko. 24. Sponke trikotnika so bile sestavljene v tri ločene sklope, od katerih je vsak kodiral zgornji kot, vmesni del in nasprotni rob. En lot (40 nM vsake sponke) smo zmešali z M13 (1 nM) v pufru TANa ([NaCl] = 100 mM) in sistem pustili inkubirati pri 25 °C brez nadaljnjega mešanja. Vsakih 24 ur smo odstranili prostornino, potrebno za slikanje AFM, dodali eno kodiranje lota za dodatni del trikotnika (40 nM vsaka sponka) in pustili sistem inkubirati pri 25 °C v pufru TANa ([NaCl] = 100 mM) . Izvedli smo dva različna načina postopnega sestavljanja, iz vogala v nasprotno stran in iz ene strani v nasprotni kot.

Izotermna priprava s streptavidinom modificiranih trikotnikov

Glej sl. 2a in dopolnilne fige. 15 in 16. V isti epruveti smo zmešali 1 nM M13, 40 nM vsake sponke, vključno z biotiniliranimi, in 2 µM streptavidina v pufru TANa, dopolnjenem s 100 mM NaCl. Vzorec smo pustili inkubirati pri 25 °C brez nadaljnjega mešanja 24 ur.

Izotermna priprava pravokotnikov SST R4

Glej sl. 2b. Vse verige pravokotnika R4 smo zmešali v pufru do končne koncentracije 100 nM v vsaki verigi v TANa, dopolnjenem s 100 mM NaCl. Vzorec smo pustili inkubirati pri 25 °C brez nadaljnjega mešanja 24 ur.

Gel elektroforeza pravokotnikov SST R4

Glej sl. 2b. 1.5 % agarozni gel (tip I z nizkim EEO, Sigma Aldrich) smo pripravili v TBE 0.5 × pufru, dopolnjenem z 11 mM MgCl₂ in GB zeleni DNK madež. Gelsko elektroforezo smo izvedli v kopeli z ledeno vodo 2 uri pri 100 V napetosti z uporabo 1 kb DNA lestve. Za čiščenje smo ciljni trak gela razrezali na majhne koščke in dali v epruveto z vrtilno kolono, kolono pa smo centrifugirali pri 5,000g za 10 min. Za slikanje AFM je bil eluirani vzorec neposredno adsorbiran na plošči sljude 10 minut v komori z nadzorovano atmosfero. Vzorec smo nato splaknili z 1 ml v 0.5 × TBE + 11 mM MgCl₂ in opazovano z uporabo AFM v 0.5 × TBE + 11 mM MgCl₂.

Izotermna priprava nanomrežij DNA

Glej sl. 2c in dopolnilna slika 17. Devet oligonukleotidov (1 µM vsakega nukleotida) smo zmešali v pufru TANa, dopolnjenem s 100 mM ali 150 mM NaCl. Vzorec smo pustili inkubirati pri 25 °C brez nadaljnjega mešanja 24 ur.

Toplotno žarjenje 3D origamisov

Glej sl. 3a in dopolnilna slika 18. Ogrodje (7,560 nt M13 za Tb, 8,064 nt M13 za T1) in mešanico sponk (10 × presežek v vsaki sponki) smo zmešali v pufru, ki je vseboval 5 mM Tris–HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA in 18 mM MgCl₂. Zmes smo segrevali na 65 °C 15 minut, da smo denaturirali vse DNA verige, preden smo jo počasi ohladili v gradientu od 60 °C do 40 °C, v 41 urah, da smo žarili in sestavili 3D origami nanostrukture.

TEM z negativnim madežem

Glej sl. 3 in dopolnilna slika 18. Za karakterizacijo TEM smo nanostrukture DNA najprej očistili iz 1 % agaroze (0.5 × TBE, 45 mM Tris-borata, 1 mM EDTA, pH 8.3), dopolnjene z 11 mM MgCl₂ in 0.5 mg ml^-1 Sybr VARNO. Vzorce smo 3 ure migrirali na gel s tekočim pufrom 0.5 × TBE, 11 mM MgCl₂ pri 2.85 V cm^-1 pri sobni temperaturi. Trakove, ki ustrezajo samosestavljenim strukturam, smo izrezali in prenesli v centrifugalno kolono za gelsko ekstrakcijo DNA (Merck) in centrifugirali pri 5,000 g 5 minut pri 4 °C. Očiščeni origami so bili nato z adsorpcijo odloženi na mrežico, prevlečeno z žarilnim praznjenjem (Quantifoil Micro Tools), obarvani 60 s z 2 % (m/v) vodno raztopino uranil acetata (Merck) in nato posušeni s filtrirnim papirjem brez pepela (VWR). ). Opazovanja TEM so bila izvedena na mikroskopu JEM-1400 Flash Tungsten, ki deluje pri 120 kV in je opremljen s kamero Gatan OneView.

Izotermno tekmovanje

Glejte dodatno sliko. 20. Na kratko smo vrtinčili mešanice dveh nizov sponk, ki kodirajo trikotnike in pravokotnike (40 nM končna koncentracija za vsako sponko) s pufrom (TANa, dopolnjen s 100 mM NaCl), preden smo mešanici dodali M13 (1 nM končna koncentracija) in nežno premešali s pipeto. Vzorec smo pustili inkubirati pri 25 °C brez nadaljnjega mešanja.

AFM opazovanje nanostruktur DNK v tekočini

Za vse podatke in slike AFM, prikazane v tem članku, so bila uporabljena okoljska opazovanja visoke ločljivosti AFM v medpomnilniku vzorcev. Razen sl. 4 (glej poseben protokol spodaj), so bile nanostrukture DNA, pridobljene v pufru TANa (origami DNA z ali brez modifikacije proteina, pravokotniki SST R4, nanomreže DNA), adsorbirane na sveže razcepljene diske iz sljude s premerom 10 mm (razred Nano-Tec V-1 Muscovite, Micro to Nano Innovative Microscopy Supplies), ki je bil predhodno prilepljen na kovinski disk in obdelan z 20 µl raztopine sperminijevega tetraklorida (0.1 M v vodi MilliQ) 10 minut in obilno opran, najprej z vodo MilliQ in nato s pufrom TANa. Za adsorpcijo vzorca smo 15–20 µl vzorca nanesli na sveže s sperminom obdelano sljudo in pustili, da se adsorbira 10 minut, razen pri poskusih izotermne transformacije (sl. 5 in dopolnilne fige. 21-23), kjer je bil čas povečan na 20 minut zaradi nižje koncentracije origamisov. Ploščo s sljudo smo nato nežno splaknili z 200 µl pufra, da smo odstranili presežek sponk in neadsorbiranih predmetov. Da bi preprečili izsušitev vzorca med manipulacijo s sljudo, smo na vrhu adsorbiranega vzorca pustili tanko plast pufra in ga hranili pri sobni temperaturi v komori z nadzorovano atmosfero (zaprti vsebnik, ki vsebuje kos robčka Kimtech, navlaženega z MilliQ voda). Isti protokol je bil izveden z vzorci, ki vsebujejo magnezij (dodatna slika XNUMX). 1, pufri TAEMg in TAMg), razen da so bili vzorci neposredno adsorbirani 5 minut na sveže razcepljeno sljudo brez kakršne koli obdelave. Vzorci so bili opazovani z mikroskopom na atomsko silo Cypher ES (Oxford Instruments) v načinu tapkanja z resonančno frekvenco 17–45 kHz v tekočini in 0.09 Nm^-1 konico s konstantno silo (BL-AC40TS, Olympus), z uporabo načina fototermalnega vzbujanja blueDrive. Neobdelane slike so bile podvržene polinomskemu odštevanju ozadja, popravku na ravni ravnine, poravnavi vrstic z različnimi metodami in vodoravni korekciji brazgotin v Gwyddionu.

Slikanje v realnem času izotermne evolucije Λ → Δ na površini lipidnega dvosloja

Glej sl. 4, dopolnilno besedilo 3 in dopolnilni filmi 1-4. Podprti lipidni dvosloji (SLB) so bili pridobljeni iz liposomov DOPC z našo prej opisano metodo³⁷. Vezikle smo pripravili iz kloroformske zaloge DOPC. Po izhlapevanju kloroforma pod tokom plinastega dušika smo lipide rehidrirali v vodi MilliQ, da smo dosegli končno koncentracijo lipidov 2 mg ml^-1. Mešanico lipidov smo nato vrtinčili in sonikirali 60 minut, da smo proizvedli majhne enoslojne vezikle. Da bi preprečili sušenje dvoslojev, so bili naslednji koraki izvedeni v komori z nadzorovano atmosfero. SLB-ji so bili oblikovani z odlaganjem 2 ml raztopine veziklov na sveže razcepljene plošče sljude (ki so bile predhodno prilepljene na magnetno kovinsko ploščo z lepilom), čemur je sledilo 2 µl TAEMg (tris–acetat 1×, [EDTA] = 1 mM, [MgCl₂] = 12.5 mM). Po 30 minutah adsorpcije smo vzorec splaknili z 2 µl pufra TAEMg, da smo odstranili neadsorbirane liposome, in ta adsorpcijski postopek ponovili drugič, da smo zagotovili optimalno pokritost površine sljude z dvoslojem. Na koncu adsorpcijskega procesa smo vzorec splaknili s 5 µl TAENa (tris–acetat 1×, [EDTA] = 1 mM, [NaCl] = 100 mM), da zagotovimo, da ne bo ostalo prostega Mg²⁺ ionov na vzorcu, kar bi preprečilo izotermno zlaganje origamisa.

Origami v obliki črke Λ, modificirani s holesterolom (dodatna slika XNUMX). 19) smo pripravili z mešanjem raztopine 10 nM M13 v pufru TAENa z 20 nM vsake od sponk in žarjenjem z znižanjem temperature s 70 °C na 4 °C s hitrostjo -0.1 °C min.^-1. Nastala origami raztopina je bila uporabljena brez nadaljnjega čiščenja. Nato smo 2 µl raztopine Λ origamisa, modificirane s holesterolom, nanesli na predhodno oblikovan SLB, čemur je sledilo 2 µl pufra TAENa. Vzorec smo inkubirali 60 minut pri sobni temperaturi v komori z nadzorovano atmosfero, površino pa smo nato neposredno slikali pri sobni temperaturi (T = 26 °C) z AFM v 20 µl pufra TAENa brez izpiranja površine. Po izbiri položaja, ki vsebuje zadostno število Λ origamisov, adsorbiranih na SLB, je bilo v vzorec dodanih 8 µl sponk na strani A v TAENa, ne da bi ga premaknili ali odstranili iz stopnje AFM. Raztopino, ki je previsela nad vzorcem, smo nato nežno premešali s počasnim večkratnim premikanjem sonde AFM gor in dol, da bi pospešili difuzijo na sponkah na strani A proti površini sljude. Isti položaj je bil nato v povprečju skeniran vsake 3 minute 223 minut. Ločljivost slike je bila 512 × 512 od t = 0 do t = 41 min in je bil nato spremenjen na 640 × 640 z merilo slik je bilo 0–10 nm od t = 0 do t = 47 min in 0–7 nm zatem. Zaradi izhlapevanja med postopkom slikanja smo dodali dodatni pufer (8 µl) pri t = 63 min, t = 144 min in t = 161 min, nato pa smo dodali še 8 µl sponk na strani A t = 170 min.

Slike AFM so bile pridobljene v TAENa pri sobni temperaturi z uporabo mikroskopa za atomsko silo Brücker Fast Scan v načinu tapkanja. Vsi poskusi AFM so bili izvedeni s sondami Olympus. Slike, pridobljene s tem protokolom, so prikazane na sl. 4 in dopolnilni filmi 1-4.

Izotermna morfološka transformacija

Glej sl. 5 in dopolnilne fige. 21-23. Pravokotne origami DNK brez ali s skrajšanimi sponkami so najprej pripravili s termičnim žarjenjem: po sestavljanju 1 nM predloge M13 z mešanico sponk (po 40 nM) v pufru TANa (s 100 mM ali 150 mM NaCl), vzorec smo inkubirali 10 minut pri 90 °C in nato izpostavili termični rampi v peqSTAR 2X termociklerju (Peqlab) od 70 °C do 20 °C s hitrostjo –0.1 °C na 2 minuti. Trikotne sponke smo nato zmešali neposredno v vzorec, brez kakršnega koli čiščenja (pravokotne sponke hranimo v sistemu), s pipeto do želene koncentracije (10 ali 100 nM vsake sponke) s končno koncentracijo 0.25 nM v [M13] in 10 nM v vsako pravokotno sponko. Nastali vzorec smo pustili inkubirati pri 25 °C ali 30 °C brez nadaljnjega mešanja.

Statistika in obnovljivost

Razen poskusa, prikazanega na sl. 4, ki je bila zaradi zapletenosti nastavitve izvedena le enkrat, so bile vse druge preiskave večkrat ponovljene, da se zagotovi ponovljivost. Vse analize slik AFM so bile izvedene na velikem številu n posameznih origamijev, vzetih iz različnih slik, na različnih položajih vzorcev, pridobljenih v enakih pogojih. Vsi odkriti origami so bili analizirani. Noben origami, pravilno zložen ali ne, ni bil izključen iz teh analiz. Število n analiziranih predmetov v vsakem stanju, prikazanem na različnih slikah, je prikazano v dodatnih tabelah 1-5. Za vnaprejšnjo določitev velikosti vzorca ni bila uporabljena nobena statistična metoda. Iz analiz ni bil izločen noben podatek. Poskusi niso bili naključni. Raziskovalci niso bili zaslepljeni glede dodelitve med poskusi in oceno rezultatov.