Zwierzęta
Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Protokoły zostały zatwierdzone przez Lokalną Komisję Etyki Zwierząt (Komisja Karola Darwina nr 5, nr rejestracyjne 9529 i 26889) i przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE. Samce szczurów Long-Evans w wieku od 2 do 12 miesięcy i samce myszy WT (C57BL / 6J) w wieku 9 tygodni uzyskano z Janvier Laboratories; Transgeniczne samce szczurów P23H (linia 1) (9–22 miesiące) hodowano lokalnie.
Klonowanie plazmidów i wytwarzanie AAV
Plazmidy zawierające E. coli mscL sekwencję w postaci WT iz mutacją G22S otrzymano od Francesco Difato (plazmidy Addgene #107454 i #107455)28. Aby celować w RGC, promotor SNCG31 wstawiono do plazmidu szkieletowego AAV zawierającego mgr sekwencja połączona z genem tdTomato i sygnałem eksportowym Kir2.1 ER, aby kierować ekspresją w błonie plazmatycznej. Do dostarczania do ciała szklistego zastosowano wektor AAV2.7m8. W celu ukierunkowania neuronów w warstwach korowych V1 promotor SNCG zastąpiono promotorem CamKII i wybrano wektor AAV9.7m8. Rekombinowane AAV wytworzono metodą kotransfekcji plazmidowej, a otrzymane lizaty oczyszczono metodą oczyszczania jodiksanolem31.
Bodziec amerykański
Zastosowano trzy zogniskowane głowice USG o różnych częstotliwościach centralnych: 0.50 MHz (średnica, Ø = 1.00″ = 25.4 mm; odległość ogniskowa, f = 1.25″ = 31.7 mm) (V301-SU, Olympus), 2.25 MHz (Ø = 0.50″ = 12.7 mm, f = 1.00″ = 25.4 mm) (V306-SU, Olympus) i 15.00 MHz (Ø = 0.50″ = 12.7 mm, f = 1.00″ = 25.4 mm) (V319-SU, Olympus), odpowiadające aperturom numerycznym F/Ø = 1.25 i 2.00. Pola akustyczne emitowane przez te trzy skupione przetworniki przedstawiono na rys. 1 (symulacje) i dane rozszerzone Ryc. 3 (pomiary eksperymentalne). TiePie Handyscope (HS5, TiePie Engineering) użyto do wytworzenia kształtu fali bodźca, który następnie przepuszczono przez wzmacniacz mocy RF 80 dB (VBA 230-80, Vectawave) podłączony do przetwornika. Wyjścia ciśnienia przetwornika (ciśnienie w ognisku, trójwymiarowe (3D) mapy ciśnienia) mierzono w odgazowanym zbiorniku wody za pomocą heterodynowego interferometru Royer-Dieulesaint47. Bodźce US zastosowane do stymulacji ex vivo i in vivo charakteryzowały się następującą charakterystyką: częstotliwość powtarzania impulsów 1 kHz z 50% cyklem pracy, czas trwania sonikacji od 10 do 200 ms i odstęp między bodźcami od 0.01 do 2.00 s. Szczytowe wartości ciśnienia akustycznego wynosiły od 0.11 do 0.88 MPa, od 0.30 do 1.60 MPa i od 0.20 do 1.27 MPa odpowiednio dla przetworników 0.50, 2.25 i 15.00 MHz. Odpowiednie oszacowane przestrzenne wartości szczytowej średniej intensywności tętna (Isppa) wynosiły 0.39–25.14, 2.92–83.12 i 1.30–52.37 W·cm-2.
Dostarczanie genów do ciała szklistego i obrazowanie siatkówki
Szczury uśpiono48 i zawiesina AAV (2 µl), zawierająca od 8 do 14 × 1010 cząstki wirusowe wstrzyknięto do środka jamy ciała szklistego. Miesiąc później wykonano obrazowanie fluorescencyjne tdTomato na wstrzykniętych oczach za pomocą mikroskopu do obrazowania siatkówki MICRON IV (Phoenix Research Laboratories) i Micron Discover v.2.2.
Nagrania MEA
Kawałki siatkówki spłaszczano na membranie filtracyjnej (Whatman, GE Healthcare Life Sciences) i umieszczano na MEA (średnica elektrody, 30 µm; odstępy, 200 µm; MEA256 200/30 iR-ITO, MultiChannel Systems) powleczone poli-l-lizyna (0.1%, Sigma), z RGC skierowanymi w stronę elektrod31. AMPA/kainianowy antagonista receptora glutaminianu 6-cyjano-7-nitrochinoksalino-2,3-dion (CNQX, 25 μM, Sigma-Aldrich), antagonista receptora glutaminianu NMDA [3H]3-(2-karboksypiperazyn-4-ylo)propyl kwas -1-fosfonowy (CPP, 10 μM, Sigma-Aldrich) i selektywny agonista metabotropowego receptora glutaminianu grupy III, lKwas -(+)-2-amino-4-fosfonomasłowy (LAP4, 50 μM, Tocris Bioscience) poddawano kąpieli przez linię perfuzyjną. Bodźce świetlne dostarczano za pomocą cyfrowego wyświetlacza mikrolustrzanego (Vialux; rozdzielczość, 1,024 × 768) połączonego ze źródłem światła emitującego białe światło diodowe (MNWHL4, Thorlabs) skupionym na płaszczyźnie fotoreceptora (natężenie promieniowania, 1 µW cm--2). Przetworniki US połączono z wykonanym na zamówienie stożkiem sprzęgającym wypełnionym odgazowaną wodą i zamontowano na zmotoryzowanym stoliku (PT3/M-Z8, Thorlabs) umieszczonym prostopadle nad siatkówką. Odbity sygnał chipa MEA i siatkówki został wykryty za pomocą amerykańskiego urządzenia kluczowego (Lecoeur Electronique). Odległość między siatkówką a przetwornikiem była równa ogniskowej przetwornika; zostało to zweryfikowane z czasem przelotu odbitego sygnału. Z nagrań RGC z 252-kanałowym przedwzmacniaczem i MC_Rack v. 4.6.2 (MultiChannel Systems), kolce zostały posortowane za pomocą oprogramowania Spyking CIRCUS 0.549. Odpowiedzi RGC analizowano za pomocą niestandardowych skryptów napisanych w MATLAB (MathWorks 2018b) w celu klasyfikacji jako ON, ON-OFF lub OFF, z indeksem dominacji odpowiedzi50. Latencje obliczono jako czas między początkiem bodźca a maksimum pochodnej funkcji gęstości pików (SDF). Na podstawie latencji zidentyfikowano dwie klasy komórek reagujących na US - SL i LL - ustalając próg równy minimalnemu rozkładowi latencji odpowiedzi komórek NT na US (45 ms). Ustaliliśmy wartość szczytową A SDF do obliczenia czasu trwania odpowiedzi, który zdefiniowano jako przedział czasu między dwoma punktami czasowymi, dla których SDF był równy A/e (gdzie A jest pikiem depolaryzacji i e jest liczbą Eulera). Współczynnik Fano, kwantyfikujący zmienność liczby skoków, obliczono jako stosunek wariancji liczby skoków do średniej. Odległość euklidesową między dwiema aktywowanymi komórkami ważono zgodnie z maksymalną szybkością wypalania komórek. Stosunek liczby aktywowanych komórek do wielkości stymulowanego obszaru na chipie MEA obliczono biorąc pod uwagę rozmiar ogniska US dla 2.25 i 15.00 MHz oraz rozmiar MEA dla 0.50 MHz, ponieważ ognisko było większe niż MEA dla tej częstotliwości. Środek odpowiedzi oszacowano, ważąc maksymalną szybkość wystrzeliwania każdej komórki przez jej odległość od innych odpowiadających komórek, a przemieszczenie odpowiedzi obliczono jako odległość euklidesową między dwoma pozycjami środka odpowiedzi.
Zastrzyki wewnątrzczaszkowe
Zawiesiny AAV wstrzykiwano do prawej półkuli szczurów w dwóch różnych miejscach (2.6 mm ML, 6.8 mm AP i 3.1 mm ML, 7.2 mm AP od bregma) lub w jednym miejscu u myszy (2.5 mm ML, 3.5 mm AP od brgma)48. Do iniekcji szczurów zawiesina (200 nl zawierająca 0.2–8.0 × 1015 wirusowe) wstrzyknięto na trzy różne głębokości (1,100, 1,350 i 1,500 µm od powierzchni korowej) za pomocą kontrolera pompy mikrostrzykawki (Micro4, World Precision Instruments) działającej z szybkością 50 nl min-1 i 10 ul strzykawki Hamiltona. U myszy zawiesina AAV (1 µl zawierająca 0.2–8.0 × 1015 cząstki wirusowe) wstrzykiwano w odległości 400 µm od powierzchni korowej z szybkością 100 nl min-1.
Nagrania zewnątrzkomórkowe in vivo
Miesiąc po wstrzyknięciach AAV wykonano małą kraniotomię (5 × 5 mm2) przeprowadzono powyżej V1 w prawej półkuli48. Fluorescencję tdTomato sprawdzono za pomocą mikroskopu do obrazowania siatkówki MICRON IV i Micron Discover v. 2.2 (Phoenix Research Laboratories). 32-miejscowy układ elektrod µEcog (średnica elektrod, 30 µm; rozstaw elektrod, 300 µm; FlexMEA36, MultiChannel Systems) umieszczono nad transfekowanym regionem lub w podobnej strefie dla szczurów kontrolnych. Zapisy MEA przeprowadzono za pomocą 16-miejscowej silikonowej mikrosondy nachylonej pod kątem 45° do powierzchni mózgu (średnica elektrody, 30 µm; odstęp, 50 µm; A1x16-5mm-50-703, NeuroNexus Technologies) i MC_Rack v. 4.6.2. MEA wprowadzono na głębokość 1,100 µm do kory za pomocą trójosiowego mikromanipulatora (Sutter Instruments). Przetworniki US połączono z mózgiem za pomocą wykonanego na zamówienie stożka sprzęgającego wypełnionego odgazowaną wodą i żelem US na zmotoryzowanej scenie. Odległość między korą a przetwornikiem była równa ogniskowej przetwornika. Bodźce wzrokowe były generowane przez diodę elektroluminescencyjną skolimowaną w świetle białym (MNWHL4, Thorlabs) umieszczoną 15 cm od oka (4.5 mW cm--2 przy rogówce). Nagrania zostały zdigitalizowane za pomocą 32- i 16-kanałowych wzmacniaczy (model ME32/16-FAI-μPA, MultiChannel Systems). Nagrania µEcog analizowano za pomocą specjalnie opracowanych skryptów MATLAB, a nagrania MEA analizowano za pomocą oprogramowania Spyking CIRCUS i niestandardowych skryptów MATLAB. Czas trwania odpowiedzi obliczono jako odstęp między dwoma punktami czasowymi, w których potencjał wywołany kory mózgowej był równy A/e. Aktywowany obszar zdefiniowano jako obszar mapy aktywacji pseudokoloru, w którym depolaryzacja piku przekroczyła poziom szumu tła obliczony jako 2 × sd sygnału. Centrum odpowiedzi oszacowano, ważąc szczytową depolaryzację każdej elektrody według jej odległości od innych elektrod. Jego względne przemieszczenie podczas przesuwania przetwornika US obliczono jako odległość euklidesową dwóch położeń. W przypadku zapisów wewnątrzkorowych latencję komórek oszacowano jako czas między początkiem bodźca a maksimum pochodnej SDF.
Chirurgia do testów behawioralnych in vivo
Myszom C57BL6J wstrzyknięto podskórnie buprenorfinę (0.05 mg kg-1) (Buprécare, Axience) i deksametazon (0.7 mg kg-1) (Dexazone, Virbac). Zwierzęta znieczulono izofluranem (5% indukcja i 2% podtrzymanie, w mieszaninie powietrze/tlen), a głowy ogolono i oczyszczono roztworem antyseptycznym. Głowy zwierząt mocowano na ramie stereotaktycznej z systemem dostarczania izofluranu i maścią do oczu, a na oczy nakładano czarną chusteczkę. Temperaturę ciała utrzymywano na poziomie 37°C. Po miejscowym wstrzyknięciu lidokainy (4 mg kg-1) (Laocaïne, Centravet), na skórze wykonano nacięcie. W czaszce po małej kraniotomii (około 5.0 × 5.0 mm) wkręcono dwie śruby.2) wykonano powyżej V1 w prawej półkuli (stalowe wiertło 0.5 mm) i zastosowano bufor korowy. Korę pokryto arkuszem z tworzywa sztucznego TPX (grubość 125 µm) i uszczelniono dentystycznym cementem akrylowym (Tetric Evoflow). W celu przeprowadzenia eksperymentów behawioralnych metalowa belka na głowę (PhenoSys) do mocowania głowy została następnie przyklejona do czaszki na lewej półkuli za pomocą cementu dentystycznego (FujiCEM 2). Zwierzęta umieszczono w komorze wybudzeniowej, z podskórnym wstrzyknięciem fizjologicznej surowicy i maści na oczy (Ophtalon, Centravet). Buprenorfinę wstrzykiwano podczas monitorowania pooperacyjnego.
Testy behawioralne myszy
Myszom poddano harmonogram ograniczenia wody, aż osiągnęły około 80–85% swojej wagi. Po przyzwyczajeniu do warunków testowych36, myszy trenowano, aby reagowały na LS, wykonując dobrowolne zadanie wykrywania: lizanie trąby wodnej (tępa igła o rozmiarze 18, około 5 mm od ust) w odpowiedzi na stymulację pełnego pola białym światłem (długość 200 i 50 ms) oko lewe (rozszerzone tropikamidem, Mydriaticum Dispersa) w ciągu 35 prób na czas trwania stymulacji, czyli 70 prób dziennie. Woda (~4 μl) była automatycznie dozowana 500 ms po włączeniu światła przez skalibrowany system wodny. Protokół behawioralny i wykrywanie lizania były kontrolowane przez system wykonany na zamówienie36. Przez kolejne cztery dni (dwudniowa przerwa w weekend) stymulacje USG wykonywano na V1 przez 50 ms przy trzech różnych wartościach ciśnienia (0.2, 0.7 i 1.2 MPa). Te wartości ciśnienia były podawane każdego dnia w innej kolejności (po 35 prób). Odstępy między próbami zmieniały się losowo i wynosiły od 10 do 30 sekund. Przetwornik US 15 MHz połączono z mózgiem za pomocą wykonanego na zamówienie stożka sprzęgającego wypełnionego wodą i żelem US. Współczynnik powodzenia obliczono przez zliczenie liczby prób, w których myszy wykonały wyprzedzające lizanie (między początkiem bodźca a otwarciem zaworu wodnego). Przewidywana szybkość lizania (ryc. 6e) dla sesji obliczono przez odjęcie od przewidywanej szybkości lizania próby, spontanicznej szybkości lizania (obliczonej we wszystkich 1-sekundowych oknach czasowych przed każdym pojedynczym początkiem bodźca (ryc. 6a) dla wszystkich prób) i pomnożenie przez wskaźnik sukcesu. Opóźnienie lizania obliczono przez określenie czasu do pierwszego antycypacyjnego lizania po wystąpieniu bodźca. Myszy zatrzymane do analizy wykazywały wskaźnik sukcesu wyższy lub równy 60% czwartego dnia po LS. Następnie wykluczono sesje light lub US wykazujące zachowanie kompulsywnego lizania na podstawie identyfikacji wartości odstających wykonanej metodą ROUT (Q = 1%) na spontanicznej szybkości lizania sesji, uśredniając pomiary ze wszystkich prób sesji w oknie czasowym 1 s przed początkiem bodźca próby.
Immunohistochemia i obrazowanie konfokalne
Próbki inkubowano przez noc w 4°C z przeciwciałem monoklonalnym anty-RBPMS (1:500, królik; ABN1362, Merck Millipore) dla siatkówki31z przeciwciałem monoklonalnym anty-NeuN (1:500, mysz, klon A60; MAB377, Merck Millipore) do skrawków mózgu48. Następnie skrawki inkubowano z drugorzędowymi przeciwciałami skoniugowanymi z Alexa Fluor 488 (1:500, ośle anty-mysie i ośle anty-królicze IgG 488, poliklonalne; odpowiednio A-21202 i A-21206, Invitrogen) i DAPI (1:1,000 ; D9542, Merck Millipore) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Mikroskop konfokalny Olympus FV1000 z obiektywem × 20 (UPLSAPO 20XO z aperturą numeryczną 0.85, 10) został użyty do uzyskania obrazów płaskich siatkówek i skrawków mózgu (oprogramowanie FV4.2-ASW v. XNUMX).
Na obrazach konfokalnych przetworzonych za pomocą Fidżi (ImageJ v. 1.53q) komórki RBPMS- i NeuN-dodatnie zostały automatycznie zliczone za pomocą wtyczki „analizuj cząstki”. Komórki zostały zliczone ręcznie przez dwóch różnych użytkowników za pomocą wtyczki „licznik komórek”. Ocenę ilościową przeprowadzono przez uzyskanie stosów konfokalnych w co najmniej czterech losowo wybranych transfekowanych regionach o wielkości 0.4 mm2 (Dane rozszerzone rys. 1). W przypadku neuronów V1 dla każdego zwierzęcia wybrano strzałkowy skrawek mózgu z największą strefą fluorescencji tdTomato. Obszar będący przedmiotem zainteresowania został ręcznie zdefiniowany w V1, a oznaczenia ilościowe przeprowadzono w co najmniej sześciu losowo wybranych obszarach o średnicy 0.4 mm2.
Symulacje nagrzewania tkanek indukowane przez USA
Do oszacowania efektów termicznych zastosowano potrójny proces: (1) symulacja pól akustycznych generowanych przez trzy przetworniki z realistycznymi parametrami akustycznymi; (2) weryfikacja, czy akustyka nieliniowa nie odgrywała istotnej roli w przenoszeniu ciepła; oraz (3) realistyczne symulacje wymiany ciepła i wzrostu temperatury indukowanego w ognisku przez US w reżimie liniowym dla parametrów użytych w tym badaniu.
Do symulacji nieliniowych wykorzystaliśmy zestaw narzędzi k-Wave firmy MATLAB, definiując geometrię przetwornika w trzech wymiarach i stosując następujące parametry ośrodka propagacyjnego (wody): prędkość dźwięku, c = 1,500 ms-1; masa objętościowa, ρ = 1,000 kg·m-3; współczynnik nieliniowości, B/A = 5; współczynnik tłumienia, α = 2.2 × 10-3 dB cm-1 MHz-y; częstotliwościowe prawo mocy współczynnika tłumienia, y = 2 (odn. 51). Symulowaliśmy quasi-monochromatyczne pola falowe 3D, używając długich impulsów po 50 cykli; dało nam to maksymalne pole ciśnienia w trzech wymiarach, jak również kształt fali w ognisku. Symulacje kalibrowano poprzez regulację ciśnienia wejściowego (wzbudzenia symulowanego przetwornika) tak, aby osiągnąć ciśnienie w ognisku mierzone w zbiorniku wodnym za pomocą rzeczywistych przetworników. Pełna szerokość przy połowie maksymalnej (FWHM) średnicy ogniska w x-y płaszczyzny wynosiła 4.360, 1.610 i 0.276 mm, a długość głównej osi w x-z płaszczyzna wynosiła 32.3, 20.6 i 3.75 mm odpowiednio dla przetworników 0.50, 2.25 i 15.00 MHz (ryc. 1b – d). Efekty nieliniowe oceniano przez oszacowanie względnej zawartości harmonicznych kształtu fali w ognisku. W przykładzie przetwornika ostrości 15 MHz na ryc. 1d, porównano sygnały eksperymentalne i symulowane w ognisku i stwierdzono, że są wysoce zgodne (dane rozszerzone, ryc. 4a). Ponadto amplituda drugiej harmonicznej jest o 19.8 dB niższa od podstawowej (20.9 dB w symulowanym przypadku), co oznacza, że jeśli energia podstawowa jest E, druga harmoniczna ma energię E/95 (Dane rozszerzone Ryc. 4b). Dlatego możemy rozsądnie pominąć efekty nieliniowe w obliczeniach efektów termicznych, ponieważ stanowią one około 1% zaangażowanej energii. Te same wnioski wyciągnięto przy 0.5 MHz i 15.0 MHz. Przybliżenia liniowej propagacji fali znacznie obniżyły koszt obliczeń symulacji. Symulacje propagacji liniowej przeprowadzono za pomocą zestawu narzędzi Field II w programie MATLAB52,53, w trybie monochromatycznym, z takimi samymi właściwościami ośrodka jak k-Wave (woda), aby uzyskać pola maksymalnego ciśnienia 3D. Te maksymalne pola ciśnień posłużyły do zbudowania terminu źródła ciepła (Q_{mathrm{US}} = frac{{alpha _{mathrm{np}}p_{mathrm{max}}^2}}{{rho _mathrm{b}c_mathrm{b}}}), Gdzie αnp jest współczynnikiem absorpcji mózgu przy rozważanej częstotliwości (59.04 Np·m-1 przy 15 MHz, obliczone z αmózg = 0.21 dBcm-1 MHz-y i y = 1.18), masa objętościowa mózgu ρmózg = 1,046 kg·m-3, prędkość dźwięku mózgu cmózg = 154 sek-1 i pmax jest polem maksymalnego ciśnienia 3D. Ten termin źródłowy został następnie wykorzystany do rozwiązania równania biociepła Penne'a (rho _{mathrm{mózg}}C_{mathrm{mózg}}timesfrac{{częściowe T}}{{częściowe t}} = matematyczna{dział}lewo( {K_mathrm{t}timesnabla T} w prawo) – rho _{ mathrm{krew}}C_{mathrm{blood}}P_{mathrm{blood}}lewo( {T – T_mathrm{a}} prawy) + Q) w k-Wave, gdzie Cmózg to ciepło właściwe krwi (3,630 J kg-1 ° C-1), Kt to przewodność cieplna mózgu (0.51 W·m-1 ° C-1), ρkrew to gęstość krwi (1,050 kg m-3), Ckrew to ciepło właściwe krwi (3,617 J kg-1 ° C-1), Pkrew jest współczynnikiem perfuzji krwi (9.7 × 10-3 s-1), Ta to temperatura tętnicy (37 ° C), Q = QUS + ρmózgγmózg i γmózg to wytwarzanie ciepła przez tkankę mózgową (11.37 W kg-1) (ref. 54,55). Początkowy warunek dla temperatury mózgu został ustawiony na T0 = 37°C.
Ta symulacja odpowiada najgorszemu scenariuszowi dotyczącemu danego wzrostu temperatury. (1) Propagacja akustyczna jest symulowana tylko w wodzie (wartość bez obniżenia), przy niższym współczynniku tłumienia (2.2 × 10-3 dB cm MHz-2.00) niż mózg (0.59 dB cm MHz-1.27), nawet jeśli część propagacji zachodzi w mózgu. The pmax mapy są zatem przeszacowane. (2) Absorpcja ciepła jest symulowana tylko w tkance mózgowej, z wyższym współczynnikiem absorpcji (0.21 dB cm MHz-1.18) niż woda, nawet jeśli część pola maksymalnego ciśnienia faktycznie znajduje się w wodzie stożka sprzężenia akustycznego. Dlatego, QUS jest nieco przeszacowany. Zmapowaliśmy temperaturę w trzech wymiarach przestrzennych i czasie i szukaliśmy punktu maksymalnego wzrostu temperatury (dane rozszerzone ryc. 4c – f).
Analiza statystyczna
Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą oprogramowania Prism (Prism 9, GraphPad). Wartości wyrażono i przedstawiono jako wartości średnie ± błąd standardowy średniej (sem) na rysunkach i w tekście, o ile nie zaznaczono inaczej. Dane analizowano w niesparowanych testach Welcha t-testy (dwustronne) lub niesparowana wielokrotność t-test z poprawką Sidaka-Bonferroniego dla porównań wielokrotnych. Testy statystyczne podano w legendach rysunków.
Podsumowanie raportowania
Dalsze informacje na temat projektu badań są dostępne w Podsumowanie sprawozdawczości dotyczącej portfela przyrody powiązane z tym artykułem.
- Dystrybucja treści i PR oparta na SEO. Uzyskaj wzmocnienie już dziś.
- Platoblockchain. Web3 Inteligencja Metaverse. Wzmocniona wiedza. Dostęp tutaj.
- Źródło: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01359-6
- :Jest
- ][P
- $W GÓRĘ
- 000
- 1
- 10
- 100
- 11
- 1996
- 2%
- 2017
- 2018
- 2020
- 2021
- 28
- 39
- 3d
- 7
- 70
- 8
- 9
- a
- powyżej
- akademicki
- dostęp
- Stosownie
- Konto
- nabyć
- nabywanie
- Aktywacja
- działalność
- faktycznie
- zaawansowany
- Po
- w wieku
- Umowa
- AL
- Alexa
- Wszystkie kategorie
- pozwala
- analiza
- Kotwica
- i
- zwierzę
- zwierzęta
- Przeciwciała
- stosowany
- zatwierdzony
- w przybliżeniu
- SĄ
- POWIERZCHNIA
- Szyk
- artykuł
- AS
- oszacowanie
- At
- Sierpnia
- automatycznie
- dostępny
- średni
- średnio
- Oś
- Kręgosłup
- na podstawie
- podstawa
- BE
- bo
- zanim
- poniżej
- pomiędzy
- Czarny
- krew
- ciało
- Mózg
- przerwa
- bufor
- budować
- by
- obliczony
- CAN
- Pojemność
- który
- walizka
- Komórki
- centralny
- centrum
- Izba
- Kanał
- Charakterystyka
- Charles
- żeton
- wybrany
- Klasy
- klasyfikacja
- kliknij
- komisja
- w porównaniu
- wszechstronny
- computing
- warunek
- przeprowadzone
- przewodność
- połączony
- za
- wobec
- zawartość
- kontrola
- kontrolowanych
- kontroler
- Odpowiedni
- odpowiada
- Koszty:
- sprzężony
- pokryty
- zwyczaj
- cykl
- Cykle
- dane
- Baza danych
- dzień
- Dni
- zdefiniowane
- definiowanie
- dostarczona
- dostawa
- gęstość
- Głębokości
- Wnętrze
- wykryte
- Wykrywanie
- ustalona
- określaniu
- oprogramowania
- urządzenie
- ZROBIŁ
- różne
- cyfrowy
- digitalizacji
- Wymiary
- odkryj
- Wyświetlacz
- dystans
- 分配
- Przewaga
- sporządzony
- napęd
- podczas
- e
- każdy
- ruchomości
- energia
- Inżynieria
- wzmocnione
- błąd
- szacunkowa
- Eter (ETH)
- etyka
- europejski
- Parlament Europejski
- oceniane
- Parzyste
- przykład
- podniecony
- wyłączony
- doświadczenie
- eksport
- wyrażone
- oko
- Oczy
- okładzina
- pole
- Łąka
- Figa
- Postać
- Postacie
- wypełniony
- filtrować
- wypalania
- i terminów, a
- ustalony
- lot
- Skupiać
- koncentruje
- następujący
- W razie zamówieenia projektu
- Nasz formularz
- znaleziono
- Czwarty
- FRAME
- Częstotliwość
- od
- funkcjonować
- funkcjonalny
- fundamentalny
- Ponadto
- ge
- GE Healthcare
- wygenerowane
- generacja
- geometria
- dany
- Ziemia
- Zarządzanie
- poprowadzi
- Hamilton
- głowa
- Zdrowie
- opieki zdrowotnej
- wyższy
- wysoko
- HTTPS
- człowiek
- i
- Identyfikacja
- zidentyfikowane
- IEEE
- zdjęcia
- Obrazowanie
- ważny
- in
- inkubowane
- indywidualny
- Informacja
- początkowy
- wkład
- instrumenty
- odsetki
- zaangażowany
- JEGO
- Klawisz
- laboratorium
- większe
- największym
- Utajenie
- Prawo
- nioski
- Legendy
- Długość
- poziom
- lizanie
- życie
- Life Sciences
- lekki
- Linia
- LINK
- powiązany
- miejscowy
- lokalnie
- usytuowany
- lokalizacja
- lokalizacji
- długo
- wyglądał
- zrobiony
- konserwacja
- poważny
- ręcznie
- mapa
- Mapy
- Masa
- materiał
- maksymalny
- MEA
- znaczenie
- Pomiary
- mechaniczny
- średni
- Merck
- metoda
- Myszy
- mikron
- Mikroskop
- minimum
- mieszanina
- ML
- Moda
- model
- MOL
- monitorowanie
- Miesiąc
- miesięcy
- usta
- przeniesienie
- MS
- wielokrotność
- Mutacja
- narodowy
- Narodowy Instytut Zdrowia
- Natura
- sieć
- sieci
- Neurony
- Nowości
- Następny
- numer
- cel
- uzyskać
- uzyskane
- of
- Olympus
- on
- ONE
- otwarcie
- operacyjny
- zamówienie
- Inne
- Inaczej
- w ciągu nocy
- parametry
- parlament
- część
- minęło
- Szczyt
- wykonywania
- feniks
- fizyczny
- sztuk
- Plazma
- Plastikowy
- plato
- Analiza danych Platona
- PlatoDane
- Grać
- wtyczka
- punkt
- zwrotnica
- teczka
- ustawione
- Pozycje
- potencjał
- power
- Detaliczność
- przedstawione
- naciśnij
- nacisk
- wygląda tak
- produkować
- Wytworzony
- Program
- niska zabudowa
- protokół
- protokoły
- pod warunkiem,
- puls
- pompa
- królik
- SZCZUR
- Kurs
- stosunek
- dosięgnąć
- osiągnięty
- real
- realistyczny
- regeneracja
- odzwierciedlenie
- w sprawie
- reżim
- region
- regiony
- Rejestracja
- otrzymuje
- Raportowanie
- reprezentowane
- Badania naukowe
- laboratoria badawcze
- Rozkład
- odpowiednio
- Odpowiadać
- odpowiadanie
- odpowiedź
- REST
- przywrócenie
- przywrócenie
- ograniczenie
- wynikły
- siatkówka
- Rosnąć
- Rola
- Pokój
- pogrom
- s
- taki sam
- scenariusz
- rozkład
- SCI
- nauka
- NAUKI
- skrypty
- druga
- wtórny
- działy
- wybrany
- selektywny
- Wrażliwość
- czujniki
- Sekwencja
- Surowica
- Sesja
- Sesje
- zestaw
- kształcie
- Sigma
- Signal
- Sygnały
- Krzem
- podobny
- symulacja
- witryna internetowa
- SIX
- Rozmiar
- skóra
- Plaster
- mały
- Tworzenie
- rozwiązanie
- Dźwięk
- Źródło
- Przestrzenne
- specyficzny
- określony
- prędkość
- kolec
- kolce
- Spot
- Rozpościerający się
- Półki na książki
- STAGE
- standard
- statystyczny
- stal
- bodziec
- Badanie
- sukces
- przełożony
- Powierzchnia
- zawieszenie
- Zawieszenia
- przełączane
- system
- systemy
- zbiornik
- cel
- kierowania
- Zadanie
- Technologies
- test
- Testy
- że
- Połączenia
- Strefa
- ich
- w związku z tym
- termiczny
- Te
- thompson
- tysiące
- trzy
- trójwymiarowy
- próg
- Przez
- czas
- Tkanki
- do
- Toolbox
- przeszkolony
- przenieść
- próba
- Próby
- Prawda
- ultradźwięk
- us
- posługiwać się
- Użytkownicy
- v1
- zatwierdzony
- wartość
- Wartości
- zawór
- VBA
- Weryfikacja
- zweryfikowana
- wizja
- vivo
- wolumetryczny
- W
- Uzdatnianie wody
- fala
- weekend
- tygodni
- waga
- DOBRZE
- który
- biały
- okna
- w
- w ciągu
- świat
- napisany
- zefirnet