In vivo sanntid positronemisjonspartikkelsporing (PEPT) og enkeltpartikkel-PET – Nature Nanotechnology

Alle reagenser ble brukt som mottatt med mindre annet er angitt. Alle kjemikalier ble kjøpt fra Sigma Aldrich bortsett fra tellekulene (CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen). ζ- Potensialet ble målt ved å bruke en Zetasizer NanoZS90 (Malvern Instruments). Størrelsen og morfologien til partiklene ble studert av SEM i et JEOL JSM 7800F Prime-mikroskop med integrert EDS for å gi elementanalysen. Partikkelstørrelse ble bestemt ved å måle 50 uavhengige partikler. Radio øyeblikkelig tynnsjiktskromatografi (ITLC) ble utviklet på Agilent Technologies glassmikrofiberkromatografipapir impregnert med kiselsyre og analysert ved hjelp av en Lablogic Flow-count TLC-skanner og en BioScan B-FC-3200 fotomultiplikatorrør (PMT) detektor ved bruk av Laura-programvare. ITLC-mobilfasen var sammensatt av 0.175 M sitronsyre og 0.325 M trinatriumcitrat i vann med mindre annet er angitt. Radioaktive prøver ble målt ved bruk av en Capintec CRC-25R (Capintec) eller en LKB Wallac 1282 Compugamma CS (PerkinElmer) for hvilke data ble samlet inn ved bruk av EdenTerm-programvare. Flowcytometrieksperimenter ble utført i en BD FACSMelody cellesorterer ved bruk av BD FACSChorus Software. PET/CT-bilder ble tatt med en NanoPET/CT-skanner (Mediso), rekonstruert ved hjelp av Nucline v.0.21-programvare, og bilder ble analysert ved hjelp av VivoQuant-programvare (versjon 3.5, InviCRO). Listemodusdata ble innhentet av et spesifikt MATLAB-programvareverktøy utviklet av Mediso. Autoradiografi ble utført i et GE Amersham Typhoon-instrument.

Syntese av silikapartikler av submikrometerstørrelse

Partiklene ble syntetisert ved å bruke Stöber-metoden. Denne metoden er basert på hydrolyse og påfølgende kondensering av silisiumalkoksyder for å produsere monodisperse, sfæriske silikapartikler²⁷. Tetraetylortosilikat (TEOS) ble brukt som silisiumkilde, ammoniakk som basiskatalysator og kaliumklorid som elektrolytt. En løsning av TEOS i etanol ble kontinuerlig tilsatt til en løsning som inneholdt katalysatoren og elektrolytten. Modifisering av reagensstartmengden eller tilsetningshastigheten gir forskjeller i partikkelstørrelsen som tidligere rapportert²⁸. Her ble det fremstilt to løsninger før syntesen av partiklene: Løsning 1 inneholdende 19.0 mmol TEOS i 33.3 ml EtOH og Løsning 2 inneholdende 0.23 mmol KCl i 9 ml ammoniakk, 65 ml EtOH og 6.75 ml H₂O. For syntesen ble løsning 2 plassert i en 250 ml rundbunnet kolbe oppvarmet til 50 °C under omrøring ved 300 rpm i 15 minutter. Deretter ble løsning 1 tilsatt dråpevis til løsning 2 (tilførselshastighet 0.2 ml min^-1). Etter tilsetning av løsning 1 ble de oppnådde partiklene renset ved sentrifugering ved 18,300g i 3 minutter og vasket med EtOH fem ganger. Til slutt, SiO₂ mikropartikler ble tørket under vakuum.

Poding av partikler i submikrometerstørrelse med silan–PEG_5k

En 20 mg ml^-1 løsning av silan-PEG_5k (Sigma Aldrich) i EtOH 98 % ble tilsatt over en løsning av smSiP ved 5 mg ml^-1 i EtOH 98 % og 2.8 % ammoniakk. Blandingen ble omrørt over natten ved romtemperatur, og partiklene ble gjenvunnet ved sentrifugering ved 18,300.g i 3 min. Til slutt ble partiklene vasket tre ganger med destillert vann og tørket under vakuum over natten. Vaskeløsningene ble frysetørket over natten og mengden ubundet silan-PEG_5k vektet for beregningen av reaksjonsutbyttet. En 0.05 mg ml^-1 løsning av smSiP–PEG_5k i destillert vann ble benyttet for ytterligere radiomerkingsreaksjoner.

[⁶⁸Ga]GaCl₃

Gallium-68 ble eluert som [⁶⁸Ga]GaCl₃ fra en Eckert og Ziegler ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-generator i ultrarent HCl (4 ml, 0.1 M) produsert i henhold til krav til god produksjonspraksis (ABX).

Konsentrasjonen av [⁶⁸Ga]GaCl₃ eluering ved kationbytte

Konsentrasjonen av elueringen ble utført ved å bruke oppsettet beskrevet i tilleggsfig. 1. Først de 4 ml av [⁶⁸Ga]GaCl₃ eluering ble lastet på en Strata-XC 33u patron (Phenomenex) og eluatet ble kastet. Deretter ble patronen vasket med 5 ml av en aceton/0.1 M HCl (80:20) løsning og eluatet ble kastet. Til slutt, den konsentrerte [⁶⁸Ga]GaCl₃ ble samlet ved å tilsette 700 ul av en aceton/0.05 M HCl (98:2)-løsning, tørket under N₂ strøm og resuspendert i 50 ul 0.5 M HEPES-buffer, (pH 4.9). Radio-TLC ble utført på de forskjellige stadiene for kvalitetskontroll. Protokollen tar omtrent 20 minutter og gir et utvinningsutbytte på 86.2 ± 8.5 %.

Radiomerking av silikapartikler i ulike konsentrasjoner med ⁶⁸Ga

Silikapartikler ble resuspendert i forskjellige konsentrasjoner (fra 1 til 0.002 mg ml^-1) i 0.5 M HEPES-buffer (pH 4.9). Deretter ble 50 µl av løsningen tilsatt i et reaksjonsrør før tilsetning av konsentrert [⁶⁸Ga]GaCl₃ eluering i 50 ul 0.5 M HEPES-buffer (pH 4.9). Reaksjoner ble utført ved 90 °C i 30 minutter, og radio-TLC ble utført for å beregne det radiokjemiske utbyttet.

Måling av partikkelkonsentrasjon ved flowcytometri

Partikkelkonsentrasjoner ble beregnet ved flowcytometri ved bruk av tellekuler (CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen) etter produsentens instruksjoner. Silikapartikler ble resuspendert ved 0.05 mg ml^-1ultralydbehandlet i 10 minutter og ført gjennom et 10 µm cut-off-filter (KX sprøytefilter, nylon, 25 mm, 10 µm). CountBright Absolute Counting Beads ble varmet opp til romtemperatur og vortexet i 30 sekunder. Deretter ble 50 µl perler tilsatt til 300 µl silikapartikler og blandingen ble virvlet i 30 minutter for å oppnå en homogen løsning. Prøven ble kjørt på strømningscytometeret og terskelen for foroverspredning (FSC) satt til å inkludere kulene og partiklene på lineær-FSC versus lineær sidespredningsplott. Etterpå ble fluorescensdetektorspenningen justert for tellekulene og en gatestrategi utført for å isolere silikapartiklene og tellekulepopulasjonene. Til slutt ble porter på partiklene og de absolutte tellende perlene tegnet og 1,000 perlehendelser ble registrert for hver prøve. Ved å bruke denne strategien ble antallet partikler i løsning beregnet ved å bruke følgende ligning:

Radiomerking av 500 smSiP

Fem hundre smSiP ble tilsatt til 50 µl av den konsentrerte [⁶⁸Ga]GaCl₃ eluering i 0.5 M HEPES-buffer pH 4.9. Deretter ble 5.6 ul polysorbat 80 tilsatt og blandingen ble oppvarmet ved 90 °C i 30 minutter ved 900 rpm i en termisk blander. Etterpå ble en endelig flertrinns renseprotokoll designet for å fjerne ureagert/kolloidalt ⁶⁸Ga. Femti mikroliter 10 mM EDTA ble tilsatt, og blandingen ble inkubert i 5 minutter ved romtemperatur. Deretter ble partiklene sentrifugert i 3 minutter ved 18,300g, resuspendert i 500 µl PBS inneholdende 1 mM EDTA + 0.1 % polysorbat 80 og vortex forsiktig i 10 s. Partiklene ble sentrifugert igjen, vasket med en løsning av 0.1 mM EDTA + 0.1 % polysorbat 80 i PBS og forsiktig vortexet i 10 s. Til slutt ble partiklene sentrifugert og vasket fem ganger til med PBS + 0.1 % polysorbat 80 og resuspendert i 500 ul PBS. Radiomerkingsreaksjonen ble overvåket med radio-TLC under de påfølgende reaksjonstrinnene for å evaluere tilstedeværelsen av kolloider (som kan forveksles med partikler hvis de ikke fjernes riktig), radiomerkingen av partiklene og renheten til sluttproduktet. RLY ble beregnet ved sammenligning mellom mengden radioaktivitet i partiklene og supernatantene etter vasketrinnene.

fraksjone

For fraksjoneringsstrategien, volumer fra 0.5 µl til 20 µl av ⁶⁸Ga-smSiP ved en teoretisk konsentrasjon på 1 partikkel µl^-1 ble tilsatt i forskjellige prøverør i trinn på 1 µl (0.5, 1, 2, 3 ...) og PBS ble tilsatt for å bringe det endelige volumet til 50 µl. Deretter ble 37.5 ul fra det første røret pipettert inn i et andre prøverør, 25 ul av det andre røret i et tredje rør og til slutt 12.5 ul av det tredje røret til et fjerde rør. Denne strategien gir fire rør per prøve med et sluttvolum på 12.5 µl per rør. Radioaktiviteten i hvert rør ble målt i en gammateller og verdiene ble beregnet i kBq ved bruk av en kalibreringskurve, for videre sammenligning og analyse. Prøvene som inneholdt mesteparten av radioaktiviteten i bare ett rør ble sonikert i 30 s ved romtemperatur og utsatt for et andre fraksjoneringstrinn. Deretter ble prøvene der all radioaktivitet ble funnet i et enkelt rør (med ubetydelig aktivitet i de tre andre rørene) brukt til ytterligere in vivo/ex vivo eksperimenter.

PET/CT fantomavbildning

Et fantombildeeksperiment ble utført med en ⁶⁸Ga-smSiP. En kanyle ble brukt til å levere partikkelen inn i et prøverør for å evaluere om en enkelt partikkel kunne forbli fanget i kanyleslangen under administrering. Kort fortalt ble fantomrøret plassert i nanoPET/CT-skanneren med enden av kanylespissen festet til røret. Etter å ha startet PET-innsamlingen, ble partikkelen resuspendert i 100 µl PBS levert med en insulinsprøyte festet til begynnelsen av kanylen. Deretter ble kanylen vasket med 50 ul PBS for å sikre levering av partikkelen inn i fantomrøret. PET-anskaffelsen ble utført i 2 timer etterfulgt av en standard CT-skanning.

In vivo PET/CT-avbildning

Dyreavbildningsstudier ble etisk gjennomgått og utført i samsvar med Animals (Scientific Procedures) Act 1986 (ASPA) UK Home Office-forskrifter som regulerer dyreforsøk. In vivo-avbildning ble utført i friske 8 uker gamle BALB/c-mus. Dyrene ble bedøvet med isofluran (2–3 % i oksygen), kanylert og plassert på skannersengen under narkose. Sengen ble varmet opp til 37 °C med indre luftstrøm for å holde dyret ved normal kroppstemperatur, og respirasjonshastigheten ble overvåket og holdt ved 60–80 pust min.^-1 gjennom hele skanningen. Det er viktig å opprettholde kontroll over dyretemperaturen, da et uventet temperaturfall kan føre til en reduksjon i hastigheten til partikkelen i blodet. En ⁶⁸Ga-smSiP (n = 4) eller ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k partikkel (n = 2) ble administrert gjennom kanylen i 100 µl PBS, etterfulgt av vask med 50 µl PBS etter å ha startet PET-innsamlingen (1:5 sammenfallsmodus; 5 ns sammenfallstidsvindu). PET ble registrert i 2 timer, og deretter ble det utført en halvsirkelformet CT-skanning. Dyrenes kroppstemperatur og respirasjonsfrekvens ble overvåket under hele prosessen. Dynamiske PET/CT-bilder ble rekonstruert ved bruk av Tera-Tomo 3D-rekonstruksjon (400–600 keV energivindu, 1:5 tilfeldighetsmodus, 20 iterasjoner og 1 delsett) ved en voxelstørrelse på 0.4 × 0.4 × 0.4 mm³ og korrigert for demping, spredning og forfall. Listemodusdata for alle PET/PEPT-anskaffelser kan finnes for ⁶⁸Ga-smSiP ved ref. ²⁹ og for ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k ved ref. ³⁰.

Sporing i sanntid

Først ble data eksportert fra skanneren i listemodusformat (det vil si et format med tidsstempel og krystallindeks for påviste tilfeldighetsfotoner). En geometrisk transformasjon ble brukt for å konvertere fra krystallindekser til posisjon i mm-enheter. Birmingham-metoden beregner iterativt MDP fra en delmengde av alle LoR-ene. Den gjør dette ved å forkaste LoR-er som er lenger enn en bestemt avstand fra MDP, da disse sannsynligvis vil oppstå fra falske LoR-er, for eksempel LoR-er som kan stamme fra spredning. MDP forfines med hver iterasjon; antall iterasjoner er effektivt satt av f-faktor og relaterer seg til det totale antallet LoR-er som brukes til å estimere den endelige partikkelposisjonen innenfor den undergruppen (for eksempel en f-faktor på 0.5 betyr at iterasjonssløyfen vil avsluttes når 50 % av LoR-ene i undersettet gjenstår). Antall LoR-er som brukes i en delmengde kan reduseres for å forbedre den tidsmessige prøvetakingen (delsettene er påfølgende i tid uten overlapping) på bekostning av å øke usikkerheten i posisjonen (ytterligere detaljer om algoritmen kan finnes i Parker et al.⁵) Birmingham-metoden ble brukt til å analysere listemodusdata fra PET-skanneren. En adaptiv prøvestørrelse ble brukt for å spore partikkelen i musene. Prøvestørrelsen ble satt for å oppnå en balanse mellom tilstrekkelig tidsmessig prøvetaking og samtidig minimere posisjoneringsfeil. En prøvestørrelse mellom 100 og 200 LoRs ble brukt i de tidlige stadiene av skanningene (<60 s fra skanningsstart), med f = 0.1, noe som gir ca. 1–5 s intervaller. Ved skannetider >60 s ble prøvestørrelsene variert mellom 1,000 og 2,000, noe som ga tidsintervaller på mellom 30 s og 60 s avhengig av in vivo-eksperimentet. Antall tellinger som brukes til å beregne MDP (i den endelige iterasjonen) kan bli funnet ved å multiplisere prøvestørrelsen med f-faktorverdi. Disse parameterne var basert på tidligere erfaringer og informert om tidligere publikasjoner¹.

Hastighet ble oppnådd som (sqrt{{v}_{x}^{2}+{v}_{y}^{2}+{v}_{z}^{2}}) hvor ({v}_{m}^{2}) er hastigheten i x, y og z retninger.

Ex vivo organopptak

Opptak i forskjellige organer ble evaluert ved gammatelling. Etter in vivo PET/CT-avbildning ble dyrene drept ved cervikal dislokasjon og organer skåret ut og veid for radioaktivitetstelling i en gammateller (LKB Wallac 1282 Compugamma CS). Data ble uttrykt som prosent injisert dose (dose i organet/total dose injisert) per gram vev (%ID g^-1).

Autoradiografi

Radioaktiviteten i lungene ble sporet med en strålingsdetektor (EP15 probe, Morgan), og lungene ble kuttet i små snitt med en skalpell inntil en liten del av vevet med det radioaktive signalet ble oppnådd. Vevet ble hurtigfrosset i -80 °C isopropanol. Umiddelbart etter frysing ble vevet innebygd i medium med optimal kuttetemperatur og kuttet i en kryostat i 20 µm skiver. Hver skive ble undersøkt med detektoren til den radioaktive skiven ble funnet. Den forrige (under bakgrunnen), radioaktive og neste (under bakgrunnen) skive ble plassert på et Superfrost-mikroskopobjektglass (Epredia). Resten av det gjenværende vevet var også under bakgrunnen. Mikroskopobjektglasset med de tre seksjonene ble dekket med matfilm og i motsetning til en GE autoradiografiplate over natten. Platen ble analysert med GE Amersham Typhoon med 25 µm oppløsning og PMT-innstilling på 4,000. Autoradiografibildet ble lagt over bildet av vevet, og viste en flekk av radioaktivitet i den radioaktive skiven. For kvantifiseringen ble standarder utarbeidet i forskjellige kjente aktiviteter, og hver ble oppdaget som 1 µl kvintett i papir. Flekkene ble inkubert i samme lagringsfosforskjerm, BAS-IP MS (Multipurpose Standard) fra GE som enkeltpartiklene ble kvantifisert. Bildet ble tatt med Amersham Typhoon 5 med Control Software versjon 2.0 i fosformodus med en pikselstørrelse på 100 µm og en følsomhet på 4,000. Bildene ble kvantifisert med programvaren ImageQantTL v10.0-261 ved bruk av gelkvantifiseringsverktøykassen. Punktene ble korrigert ved å velge en region rett før eller etter flekken som en konstant bakgrunn. Det resulterende volumet av flekken ble brukt til å beregne Bq i partikkelen på grunnlag av kalibreringskurven.

Statistikk og reproduserbarhet

For kvantitativ analyse ble minimum tre biologiske replikater analysert unntatt in vivo-data fra ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k (n = 2). Data ble analysert ved vanlig enveis variansanalyse (ANOVA) med Dunnetts multiple comparison test og Students t-test. EN P verdi <0.05 ble ansett som statistisk signifikant.

• SEO-drevet innhold og PR-distribusjon. Bli forsterket i dag.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. Styrk deg selv. Tilgang her.
• PlatoAiStream. Web3 Intelligence. Kunnskap forsterket. Tilgang her.
• PlatoESG. Karbon, CleanTech, Energi, Miljø, Solenergi, Avfallshåndtering. Tilgang her.
• PlatoHelse. Bioteknologisk og klinisk etterretning. Tilgang her.
• kilde: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01589-8