動物
実験は、実験動物の管理と使用に関する国立衛生研究所のガイドに従って実施されました。 プロトコルは、ローカル動物倫理委員会 (委員会チャールズ ダーウィン No. 5、登録番号 9529 および 26889) によって承認され、欧州議会の指令 2010/63/EU に同意して実施されました。 2〜12か月齢のLong-Evans雄ラットと57週齢のWT雄マウス(C6BL / 9J)は、Janvier Laboratoriesから入手しました。 P23H (系統 1) の雄のトランスジェニック ラット (9 ~ 22 か月) がローカルで飼育されました。
プラスミドのクローニングと AAV の生産
を含むプラスミド 大腸菌mscL WT 型の G22S 変異を含む配列は、Francesco Difato から入手しました (Addgene プラスミド #107454 および #107455)。28. RGC をターゲットするには、SNCG プロモーター31 を含む AAV バックボーン プラスミドに挿入されました。 mscL tdTomato 遺伝子と Kir2.1 ER 輸出シグナルに融合した配列で、原形質膜での発現を促進します。 硝子体内送達にはAAV2.7m8ベクターを使用した。 V2.7 皮質層のニューロンを標的とするために、SNCG プロモーターを CamKII プロモーターに置き換え、AAV8m1 ベクターを選択しました。 プラスミド共トランスフェクション法により組換え AAV を作製し、得られたライセートをイオジキサノール精製により精製しました。31.
米国の景気刺激策
異なる中心周波数を持つ 0.50 つの集束 US トランスデューサが使用されました: XNUMX MHz (直径、 Ø = 1.00インチ = 25.4mm; 焦点距離、 f = 1.25″ = 31.7 mm) (V301-SU、オリンパス)、2.25 MHz (Ø = 0.50インチ = 12.7mm、 f = 1.00″ = 25.4 mm) (V306-SU、オリンパス) および 15.00 MHz (Ø = 0.50インチ = 12.7mm、 f = 1.00″ = 25.4 mm) (V319-SU、オリンパス)、開口数に対応 F/Ø = 1.25 と 2.00。 これらの XNUMX つの集束トランスデューサーによって放射される音響フィールドを図 XNUMX に示します。 1 (シミュレーション) と拡張データ図 3 (実験測定)。 TiePie Handyscope (HS5、TiePie Engineering) を使用して刺激波形を生成し、トランスデューサに接続された 80 dB RF パワー アンプ (VBA 230-80、Vectawave) を通過させました。 トランスデューサーの圧力出力 (フォーカス時の圧力、3 次元 (XNUMXD) 圧力マップ) は、Royer-Dieulesaint ヘテロダイン干渉計を備えた脱気水タンクで測定されました。47. ex vivo および in vivo 刺激に使用される米国刺激には、次の特性がありました: 1% のデューティ サイクルで 50 kHz のパルス繰り返し周波数、10 ~ 200 ms の超音波処理時間、および 0.01 ~ 2.00 s の刺激間隔。 0.11、0.88、および 0.30 MHz トランスデューサーのピーク音圧は、それぞれ 1.60 ~ 0.20 MPa、1.27 ~ 0.50 MPa、および 2.25 ~ 15.00 MPa の範囲でした。 対応する推定空間ピーク パルス平均強度 (Isppa) 値は、0.39 ~ 25.14、2.92 ~ 83.12、および 1.30 ~ 52.37 W cm でした。-2.
硝子体内遺伝子送達と網膜イメージング
ラットは麻酔をかけられた48 および2〜8×14 を含むAAV懸濁液(10μl)10 ウイルス粒子は、硝子体腔の中心に注入されました。 2.2か月後、MICRON IV網膜イメージング顕微鏡(Phoenix Research Laboratories)およびMicron Discover v.XNUMXを使用して、注入された眼でtdTomato蛍光イメージングを実行しました。
MEA記録
網膜片をフィルター膜(Whatman、GE Healthcare Life Sciences)上で平らにし、ポリでコーティングされたMEA(電極直径、30 µm、間隔、200 µm、MEA256 200/30 iR-ITO、MultiChannel Systems)上に置きました。l-リジン (0.1%、Sigma)、RGC が電極に面している31. AMPA/カイネート グルタミン酸受容体拮抗薬 6-シアノ-7-ニトロキノキサリン-2,3-ジオン (CNQX、25 μM、Sigma-Aldrich)、NMDA グルタミン酸受容体拮抗薬 [3H]3-(2-カルボキシピペラジン-4-イル) プロピル-1-ホスホン酸 (CPP、10 μM、Sigma-Aldrich) および選択的グループ III 代謝型グルタミン酸受容体アゴニスト、 l-(+)-2-アミノ-4-ホスホノ酪酸(LAP4、50μM、Tocris Bioscience)を灌流ラインを通して浴適用した。 光刺激は、光受容体面に焦点を合わせた白色発光ダイオード光源(MNWHL2、Thorlabs)(放射照度、4μWcm-2)。 USトランスデューサーは、脱気水で満たされたカスタムメイドのカップリングコーンと結合され、網膜の上に直角に配置された電動ステージ(PT3 / M-Z8、Thorlabs)に取り付けられました。 MEA チップと網膜の反射信号は、US キー デバイス (Lecoeur Electronique) で検出されました。 網膜とトランスデューサーの間の距離は、トランスデューサーの焦点距離に等しかった。 これは、反射信号の飛行時間で検証されました。 252 チャネルのプリアンプと MC_Rack v. 4.6.2 (MultiChannel Systems) を使用した RGC の記録から、スパイクは Spyking CIRCUS 0.5 ソフトウェアでソートされました。49. RGC 応答は、MATLAB (MathWorks 2018b) で記述されたカスタム スクリプトを使用して分析され、ON、ON–OFF、または OFF として分類され、応答優勢指数が使用されました。50. 潜時は、刺激の開始とスパイク密度関数 (SDF) の導関数の最大値との間の時間として計算されました。 45 つのクラスの US 応答細胞は、US に対する NT 細胞の応答の待ち時間分布の最小値 (XNUMX ms) に等しいしきい値を固定することにより、待ち時間 (SL および LL) に基づいて識別されました。 ピーク値を決定しました A SDFが等しいXNUMXつの時点間の時間間隔として定義された応答期間の計算のためのSDFの A/e (どこで A はピーク脱分極であり、 e はオイラー数)。 スパイク数のばらつきを定量化するファノ係数は、平均値に対するスパイク数の分散の比率として計算されました。 2.25 つのアクティブ化されたセル間のユークリッド距離は、セルの最大発火率に従って重み付けされました。 MEAチップ上で刺激された領域のサイズに対する活性化された細胞の数の比率は、焦点がより大きかったため、15.00および0.50 MHzのUS焦点スポットのサイズとXNUMX MHzのMEAのサイズを考慮して計算されました。この周波数の MEA よりも。 応答の中心は、各セルの最大発火率を他の応答セルからの距離で重み付けすることによって推定され、応答の変位は、XNUMXつの応答中心位置間のユークリッド距離として計算されました。
頭蓋内注射
AAV懸濁液を、ラットの2つの異なる位置(ブレグマから2.6mmML、6.8mmAPおよび3.1mmML、ブレグマから7.2mmAP)またはマウスの1つの位置(2.5mmML、ブレグマから3.5mmAP)で右半球に注射した。ブレグマ)48. ラット注射の場合、懸濁液 (200 ~ 0.2 × 8.015 ウイルス粒子) を 1,100 つの異なる深さ (皮質表面から 1,350、1,500、および 4 μm) に注入し、マイクロシリンジ ポンプ コントローラー (Micro50、World Precision Instruments) を XNUMX nl/min の速度で動作させました。-1 および10μlのハミルトンシリンジ。 マウスでは、AAV 懸濁液 (1 ~ 0.2 × 8.015 ウイルス粒子) は、皮質表面から 400 μm の位置に 100 nl/min の速度で注入されました。-1.
インビボ細胞外記録
AAV 注射の 5 か月後、小さな開頭術 (5 × XNUMX mm2) は右半球の V1 より上で実行されました48. tdTomato 蛍光は、MICRON IV 網膜イメージング顕微鏡と Micron Discover v. 2.2 (Phoenix Research Laboratories) でチェックされました。 32 サイト µEcog 電極アレイ (電極直径、30 μm、電極間隔、300 μm、FlexMEA36、MultiChannel Systems) を、トランスフェクト領域または対照ラットの同様のゾーンに配置しました。 MEA 記録は、脳表面に対して 16° に傾けた 45 サイトのシリコン マイクロプローブ (電極の直径、30 μm、間隔、50 μm、A1x16-5mm-50-703、NeuroNexus Technologies) および MC_Rack v. 4.6.2 を使用して実行されました。 MEA は、1,100 軸マイクロマニピュレーター (Sutter Instruments) を使用して皮質に 4 μm 進めました。 米国のトランスデューサは、電動ステージ上の脱気水と米国のゲルで満たされたカスタムメイドのカップリングコーンで脳に結合されました。 皮質とトランスデューサーの間の距離は、トランスデューサーの焦点距離に等しかった。 視覚刺激は、目から15 cm離れて配置された白色光コリメート発光ダイオード(MNWHL4.5、Thorlabs)によって生成されました(XNUMX mW cm )-2 角膜で)。 録音は、32 チャンネルおよび 16 チャンネルのアンプ (モデル ME32/16-FAI-μPA、MultiChannel Systems) でデジタル化されました。 µEcog の記録はカスタム開発された MATLAB スクリプトで分析され、MEA 記録は Spyking CIRCUS ソフトウェアとカスタム開発された MATLAB スクリプトで分析されました。 応答持続時間は、皮質誘発電位が等しい XNUMX つの時点間の間隔として計算されました。 A/e. 活性化領域は、ピーク脱分極が信号の2×sdとして計算されるバックグラウンドノイズレベルを超える疑似カラー活性化マップの領域として定義されました。 応答中心は、各電極のピーク脱分極を他の電極からの距離で重み付けすることによって推定されました。 US トランスデューサを動かしたときの相対変位は、XNUMX つの位置のユークリッド距離として計算されました。 皮質内記録の場合、細胞潜時は、刺激の開始と SDF の導関数の最大値との間の時間として推定されました。
in vivo行動試験のための手術
C57BL6Jマウスにブプレノルフィンを皮下注射しました(0.05 mg kg-1) (Buprécare、Axience)、およびデキサメタゾン (0.7 mg kg-1) (デキサゾン、ビルバック)。 動物をイソフルラン(空気/酸素混合物中、5%誘導および2%維持)で麻酔し、頭を剃り、消毒液で洗浄した。 動物は、イソフルラン送達システムおよび眼軟膏を備えた定位フレームに頭を固定し、黒色の組織を眼の上に適用した。 体温は5℃に保たれています。 リドカインの局所注射後 (2 mg kg-1) (Laocaïne、Centravet)、皮膚を切開しました。 小さな開頭術 (約 5.0 × 5.0 mm2) は、右半球 (1 mm スチール ドリル) の V0.5 の上で実行され、皮質バッファーが適用されました。 皮質は TPX プラスチック シート (厚さ 125 μ m) で覆われ、歯科用アクリル セメント (Tetric Evoflow) で密封されました。 行動実験では、頭部固定用の金属製ヘッドバー (PhenoSys) を左半球の頭蓋骨に歯科用セメント (FujiCEM 2) で接着しました。 動物を回復チャンバーに入れ、生理的血清および軟膏を眼に皮下注射した(Ophtalon、Centravet)。 ブプレノルフィンは、手術後のモニタリング中に注射されました。
マウス行動試験
マウスは、体重の約80〜85%に達するまで水分制限スケジュールに入れられました。 テスト条件への順応の後36、マウスは、自発的な検出タスクを実行することにより、LS に応答するように訓練されました。左目 (トロピカミド、Mydriaticum Dispersa で拡張) 刺激持続時間あたり 18 回以上の試行、したがって 5 日あたり 200 回の試行。 水(〜50μl)は、校正された水システムを介して、ライトがオンになってから35ミリ秒後に自動的に分配されました。 行動プロトコルとリック検出は、カスタムメイドのシステムによって制御されました36. 次の 1 日間 (週末の 50 日間の休憩)、0.2 つの異なる圧力値 (0.7、1.2、および 35 MPa) で 10 ミリ秒間、V30 に米国刺激を与えました。 これらの圧力値は、毎日異なる順序で配信されました (各 15 試行)。 試行間隔はランダムに変化し、XNUMX ~ XNUMX 秒の範囲でした。 XNUMX MHz の米国トランスデューサは、水と米国のゲルで満たされたカスタムメイドのカップリング コーンで脳に結合されました。 成功率は、マウスが予測的ななめを行った試行の数を数えることによって計算されました (刺激の開始と水弁の開口部の間)。 予測的リック率 (図 6e)セッションの試行の予測的舐め率から差し引くことによって計算された自発的な舐め率(個々の刺激開始前のすべての1秒の時間枠で計算された(図. 6a) すべての試行) と成功率を掛けます。 なめる潜時は、刺激開始後の最初の予測的ななめまでの時間を決定することによって計算されました。 分析のために保持されたマウスは、LS 後 60 日目に XNUMX% 以上の成功率を示しました。 次に、強迫的な舐め行動を示す軽いまたは米国のセッションは、ROUT メソッドを使用して行われた外れ値の識別に基づいて除外されました (Q = 1%) トライアルの刺激開始前の 1 秒の時間枠でのセッションのすべてのトライアルの測定値を平均化するセッションの自発的なリック率。
免疫組織化学および共焦点イメージング
サンプルを、網膜用のモノクローナル抗RBPMS抗体(4:1、ウサギ; ABN500、Merck Millipore)とともに1362°Cで一晩インキュベートしました31、脳切片用のモノクローナル抗NeuN抗体(1:500、マウス、クローンA60、MAB377、Merck Millipore)を使用48. 次に、切片を Alexa Fluor 488 (1:500、ロバ抗マウスおよびロバ抗ウサギ IgG 488、ポリクローナル、それぞれ A-21202 および A-21206、Invitrogen) および DAPI (1:1,000 ; D9542、Merck Millipore) 室温で 1 時間。 1000倍の対物レンズ(開口数20のUPLSAPO 20XO)を備えたオリンパスFV0.85共焦点顕微鏡を使用して、フラットマウントされた網膜および脳切片の画像を取得しました(FV10-ASW v。4.2ソフトウェア)。
フィジー (ImageJ v. 1.53q) で処理された共焦点画像では、RBPMS および NeuN 陽性細胞が「粒子の分析」プラグインで自動的にカウントされました。 セルは、「セル カウンター」プラグインを使用して、0.4 人の異なるユーザーによって手動でカウントされました。 定量化は、XNUMX mm のランダムに選択された少なくとも XNUMX つのトランスフェクト領域で共焦点スタックを取得することによって実行されました2 (拡張データ図 1)。 V1 ニューロンの場合、最大の tdTomato 蛍光ゾーンを持つ矢状脳スライスを動物ごとに選択しました。 関心領域は V1 で手動で定義され、定量化は 0.4 mm の少なくとも XNUMX つのランダムに選択された領域で実行されました。2.
米国による組織加熱シミュレーション
熱効果の推定には、次の 1 つのプロセスが使用されました。 (2) 非線形音響が熱伝達に重要な役割を果たしていないことの検証。 (3)この研究で使用されたパラメーターの線形レジームで、USによって焦点で誘発された熱伝達と温度上昇の現実的なシミュレーション。
非線形シミュレーションでは、MATLAB の k-Wave ツールボックスを使用して、トランスデューサーのジオメトリを XNUMX 次元で定義し、伝播媒体 (水) に次のパラメーターを使用します: 音速、 c = 1,500 ミリ秒-1; 体積質量、 ρ = 1,000kg・m-3; 非線形係数、 B/A = 5; 減衰係数、 α = 2.2×10-3 dB cm-1 メガヘルツ–y; 減衰係数の周波数べき乗則、 y = 2 (参照。 51)。 3サイクルの長いバーストを使用して、準単色の50D波動場をシミュレートしました。 これにより、XNUMX次元の最大圧力場と焦点での波形が得られました。 シミュレーションは、入力圧力 (シミュレートされたトランスデューサーの励起) を調整して、実際のトランスデューサーを使用して水タンクで測定された焦点の圧力に達するように調整されました。 半値全幅 (FWHM) 焦点スポット径 x–y 平面は 4.360、1.610、0.276 mm で、長軸の長さは x–z 平面は、32.3、20.6、および 3.75 MHz トランスデューサーでそれぞれ 0.50、2.25、および 15.00 mm でした (図 1b–d)。 非線形効果は、焦点での波形の相対的な高調波成分を推定することによって評価されました。 図の 15 MHz フォーカス トランスデューサの例では、 1d、焦点スポットでの実験信号とシミュレーション信号を比較し、非常に一致していることがわかりました(拡張データ図. 4a)。 さらに、第 19.8 高調波の振幅は基本波より 20.9 dB 低く (シミュレートされたケースでは XNUMX dB)、基本エネルギーが E、第二高調波はエネルギーを持っています E/95 (拡張データ図 4b)。 したがって、関係するエネルギーの約 1% を占めるため、熱効果の計算では非線形効果を合理的に無視できます。 同じ結論が 0.5 MHz と 15.0 MHz で引き出されました。 線形の波動伝搬近似により、シミュレーションの計算コストが大幅に削減されました。 線形伝搬シミュレーションは、MATLAB の Field II ツールボックスを使用して実行されました。52,53、単色モードで、k-Wave (水) と同じ媒質特性で、3D 最大圧力場を取得します。 これらの最大圧力フィールドは、熱源項を構築するために使用されました (Q_{mathrm{US}} = frac{{alpha _{mathrm{np}}p_{mathrm{max}}^2}}{{rho _mathrm{b}c_mathrm{b}}})ここで、 αnp 考慮された周波数での脳の吸収係数 (59.04 Np m-1 から計算された 15 MHz で α脳 = 0.21dB・cm-1 メガヘルツ–y および y = 1.18)、脳の体積質量 ρ脳 = 1,046kg・m–3、脳の音速 c脳 = 154 秒-1 および pマックス は 3D 最大圧力フィールドです。 このソース項は、ペンネの生物熱方程式の解決に使用されました。 (rho _{mathrm{brain}}C_{mathrm{brain}}timesfrac{{partial T}}{{partial t}} = mathrm{div}left( {K_mathrm{t}timesnabla T} right) – rho _{ mathrm{blood}}C_{mathrm{blood}}P_{mathrm{blood}}left( {T – T_mathrm{a}} right) + Q) k-Wave で、ここで C脳 は血液の比熱容量 (3,630 J kg-1 ℃で-1), Kt は脳の熱伝導率 (0.51 W m-1 ℃で-1), ρ血 は血液密度 (1,050 kg m-3), C血 は血液の比熱容量 (3,617 J kg-1 ℃で-1), P血 は血液灌流係数 (9.7 × 10-3 s-1), Ta は動脈温度 (37 °C)、 Q = QUS + ρ脳γ脳 および γ脳 は脳組織の発熱です (11.37 W kg-1) (参照。 54,55)。 脳温の初期条件は T0 = 37℃。
このシミュレーションは、特定の温度上昇に関する最悪のシナリオに対応しています。 (1) 音響伝搬は、減衰係数が低い (2.2 × 10-3 dB cm MHz-2.00) 脳より (0.59 dB cm MHz-1.27)、伝播の一部が脳内で発生したとしても。 の pマックス したがって、マップは過大評価されています。 (2) 熱吸収は、より高い吸収係数 (0.21 dB cm MHz) で、脳組織のみでシミュレートされます。-1.18)最大圧力場の一部が実際に音響結合コーンの水中にある場合でも、水よりも大きくなります。 したがって、 QUS 少し過大評価されています。 温度を XNUMX つの空間次元と時間でマッピングし、温度が最大に上昇するポイントを探しました (拡張データ図 . 4c–f).
統計分析
Prismソフトウェア(Prism 9、GraphPad)を使用して統計分析を実施しました。 別段の指定がない限り、値は、図および本文中の平均値 ± 平均値の標準誤差 (sem) として表されます。 データは対応のないウェルチで分析されました t-検定 (両側) または対になっていない倍数 t-多重比較のための Sidak–Bonferroni 補正による検定。 統計検定は、図の凡例に記載されています。
レポートの概要
研究デザインの詳細については、 ネイチャー ポートフォリオ レポートの概要 この記事にリンクされています。
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- 情報源: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01359-6
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