קיפול וטיהור אוריגמי DNA
מבני אוריגמי ה-DNA (6HB, 24HB, 60HB, 13HR וננוקפסולה) קופלו בתגובה של סיר אחד על ידי הפחתה הדרגתית של הטמפרטורה באמצעות מערכת Proflex 3 × 32-PCR (Thermo Fisher). גדילי הפיגום (גרסאות p7249, p8064 ו-p7560 של M13mp18 חד-גדילי) נרכשו מ-Tilibit Nanosystems ואת גדילי היסוד מ-Integrated DNA Technologies. כדי להבטיח תפוקות קיפול גבוהות של אוריגמי DNA, נעשה שימוש בתנאים מותאמים ספציפיים למבנה הן לגבי הליכי החישול והן לגבי בחירת המאגר ('חיץ מתקפל', FOB) (הערה משלימה 20).
החלפת מאגר עבור אוריגמי DNA
מבני אוריגמי ה-DNA המטוהרים הועברו למאגר 6.5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic acid (HEPES) בתוספת של 2 mM NaOH (HEPES-NaOH, pH 6.5) לפני מורכבות עם CCMV CPs. החלפת המאגר בוצעה על ידי סינון ספין59 באמצעות מסננים צנטריפוגליים (Amicon) של 100 kDa ניתוק משקל מולקולרי (MWCO), שנשטפו לפני השימוש על ידי צנטריפוגה עם 400 μl של חיץ HEPES-NaOH למשך 5 דקות ב-14,000g. לאחר מכן, נוספו נפחים שווים של תמיסת אוריגמי DNA ומאגר HEPES-NaOH למכשיר המסנן והצנטריפוגה נמשכה במשך 10 דקות ב-6,000g. לאחר מכן הוסף נפח של HEPES-NaOH שווה ל-2.09× הנפח הראשוני של תמיסת אוריגמי, ושלב הצנטריפוגה חזר על עצמו. הדגימה נאספה על ידי היפוך המסנן וצנטריפוגה למשך 2.5 דקות ב-1,000g.
בידוד של CCMV CPs
ה-CPs בודדו מ-CCMV שלם (להכנת וירוסים, ראה הערה משלימה 21). בקצרה, חלקיקי הנגיף עברו דיאליזה בן לילה כנגד 50 מ"מ Tris-HCl, 500 מ"מ CaCl2 חיץ, pH 7.5 בתוספת 1 mM dithiothreitol (DTT) באמצעות כוסות Slize-A-Lyzer Mini Dialysis (3.5 kDa MWCO, Thermo Scientific). ה- RNA נגזר בשלב צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס באמצעות 21,100g במשך 6 שעות, והסופרנטנט שהתאושש עבר דיאליזה למשך הלילה כנגד 'חיץ נקי' המכיל 50 מ"מ Tris-HCl, 150 מ"מ NaCl ב-pH 7.5 בתוספת 1 מ"מ DTT (מותאם מ-Ref. 60). ריכוז החלבונים נקבע על סמך הספיגה שלהם ב-280 ננומטר (מקדם הכחדה, 23,590 M-1 cm-1) באמצעות BioTek Eon Microplate Spectrophotometer (דגימה של 2 μl, צלחת Take3).
גיל
נעשה שימוש ב-AGE כדי לחקור את אינטראקציית הקישור בין החלבונים למבני האוריגמי על ידי ניטור השינוי בניידות האלקטרופורטית. יתר על כן, השלמות של מבני האוריגמי לאחר קיפול וטיהור, ובמהלך עיכול DNase I, נותחה על ידי אלקטרופורזה ג'ל. לשם כך, דגימות (נפחים שנעים בין 10 ל-32 μl) בתוספת צבע טעינת ג'ל 6× (40% סוכרוז ללא צבע לדגימות ממחקרי עיכול) הופעלו בג'ל אגרוז 2% (w/v) (1 × Tris). -אצטט-אתילן-דיאמין-חומצה חומצה (TAE), 11 mM MgCl2) למשך 45 דקות ב-90 V במאגר 1 × TAE בתוספת 11 mM MgCl2. לצביעה, אתידיום ברומיד (EtBr) בריכוז סופי של 0.46 מיקרוגרם מ"ל-1 נעשה שימוש וה-DNA הוצג תחת אור אולטרה סגול באמצעות מערכת GelDoc XR+ (Bio-Rad).
מורכבות של אוריגמי DNA ו-CCMV CPs
הקומפלקס בין CPs לאוריגמי DNA בוצע בריכוז אוריגמי סופי של 4 ננומטר (10 μl דגימות). האוריגמי הוסף ביחס נפח של 1:1 לתמיסת החלבון שדוללה ב'חיץ הנקי'. בהתאם לעודף החלבון הנדרש, ε, המתאר את היחס המולארי בין אוריגמי CP ל-DNA, תמיסות חלבון הנעות בין 0 ל-60 מיקרומטר (המקביל ל ε = 0-15k) הוכנו. ריכוז ה-NaCl הותאם ל-150 mM, וכתוצאה מכך חיץ מורכב המכיל 3.25 mM HEPES-NaOH, 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl ו-0.5 mM DTT. ההרכבה בוצעה ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות ולאחר מכן נותחה באמצעות AGE ו-TEM.
מבחני עיכול DNase I
כדי לחקור את השפעת ההגנה של ציפוי CP מפני השפלה של מבני האוריגמי על ידי DNase I, 2 μl של DNase I מלאי (נע בין 0 ל- 500 KU מ"ל-1) נוספה ל-16 μl מהדגימה. בנוסף, CaCl2 ו-MgCl2 הריכוזים הותאמו, וכתוצאה מכך נפח תגובה סופי של 20 μl המכיל אוריגמי 3.2 nM DNA, 2.6 mM HEPES-NaOH, 20 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 0.4 mM DTT, 1 mM CaCl2 ו-5 mM MgCl2. הדגימות מודגרות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות (6HB) ו-60 דקות (24HB). לפני ניתוח התוצאה לפי AGE, דגימות מורכבות עם CPs פורקו באמצעות מלח הפרין נתרן כחומר מקשר תחרותי (ריכוזים סופיים של 1.5 מיקרומטר עבור 6HB-2k ו-24HB-2.5k ו-82 מיקרומטר עבור 6HB-10k ו-24HB-10k; הערה 14).
קיפול וטיהור אוריגמי RNA–DNA
עבור אוריגמי היברידי RNA-DNA (RNA-6HB), EGFP mRNA (CleanCap EGFP mRNA, TriLink Bio Technologies, L-7601) שימש כפיגום. בתגובה של סיר אחד, פיגום ה-mRNA באורך 996 nt עבר חישול תרמית עם 29 גדילי יסוד (נרכש מ-Integrated DNA Technologies, ראה הערה משלימה 22) לתוך מבנה קצר של 6HB באמצעות מערכת Proflex 3 × 32-PCR (Thermo Fisher). המבנה מתוכנן להכיל שני הצלבות פיגומים ויש לו גובה סלילי של 11 bp לכל סיבוב. לתגובת הקיפול, ה-mRNA והסיכות הודללו לתוך 1 × FOB המכיל 1 × TAE pH 8.4, 5 mM MgCl2 ו-1 mM NaCl שמגיעים לריכוזים סופיים של 50 ננומטר ו-500 ננומטר, בהתאמה. תערובת התגובה הודגרה ב-55 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות61 והתקרר על ידי הנחתו על קרח למשך 10 דקות לפחות לפני האחסון ב-4 מעלות צלזיוס. כדי לאמת את הקיפול, הוחלפו ארבעה גדילי סיכות עם גדילי סיכות המכילים תליה של 3 אינץ' (מסומן ב-F, טבלה משלימה 2). לאחר מכן ניתן לשלב במבנה גדיל התקשרות המכיל פלואורופור (ATTO590, Integrated DNA Technologies), שהתווסף לתערובת המתקפלת בעודף של 10× לכל אתר התקשרות על ידי הכלאה עם נקודות ההצמדה.
המבנים המקופלים טוהרו מעודפי גדילי סיכות על ידי סינון ספין. לשם כך, המסנן (100 kDa MWCO, Amicon) נשטף עם 400 μl של 1 × FOB על ידי צנטריפוגה ב-14,000g במשך 5 דקות, ולאחר מכן תוספת פעמיים של 40 μl RNA-6HB יחד עם 40 μl של 1 × FOB. לאחר שלב צנטריפוגה ב-6,000g במשך 10 דקות, נוספו 80 μl של 1 × FOB והצנטריפוגה נמשכה (6,000g, 10 דק). שלב הכביסה הזה חזר על עצמו בסך הכל שלוש פעמים לפני שהדגימה הוחזרה על ידי היפוך המסנן לצינור נקי (1,000g, 2.5 דקות). הריכוז נקבע על ידי מדידת הספיגה ב-260 ננומטר (מקדם הכחדה, 1.29 × 107 M-1 cm-1), והקיפול המוצלח נקבע על ידי AGE (3.5% (w/v) ג'לים, הדמיה באור אולטרה סגול (ערוץ EtBr) ואור אדום (ערוץ A647), מערכת ChemiDoc MP, Bio-Rad), AFM ו-TEM.
מורכבות של אוריגמי RNA-6HB ו-CCMV CPs
לצורך הקומפלקס, אוריגמי RNA-6HB מטוהר ב-1 × FOB מעורבב עם קפסידים CCMV ב'חיץ נקי' ביחס של 1:1 בריכוז אוריגמי היברידי סופי של 7.5 ננומטר. כתוצאה מכך נוצר חיץ מורכב המכיל 45 מ"מ טריס, 75.5 מ"מ NaCl, 10 מ"מ חומצה אצטית, 2.5 מ"מ MgCl2, 0.5 מ"מ DTT ו-0.5 מ"מ EDTA. הדגימות הודגרו ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות לפני הניתוח עם AGE ו-TEM.
מורכבות של אוריגמי DNA ו-NoV CPs
NoVLPs הוכנו כפי שדווח על ידי Lampinen et al.62 ומאוחסן ב-1 × מלח פוספט (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaCl)2HPO4 ו-1.8 מ"מ KH2PO4, pH 7.4); עם זאת, כאן SpyTag003 (ref. 63) הותך לקצה ה-C של ה-VP1 מזן NoV Hu/GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU. החלקיקים עברו בקרת איכות באמצעות פיזור אור דינמי להיווצרות חלקיקים, אלקטרופורזה של ג'ל סודיום דודקיל סולפט פולי-אקרילאמיד לטוהר החלבון ונמדדה שארית ה-dsDNA. עבור הקומפלקס עם אוריגמי DNA, אוריגמי DNA היה נוכח בדגימה גם במהלך הפירוק וגם ההרכבה מחדש של ה-VLPs. לשם כך, מבני האוריגמי הועברו למים מופחתים באמצעות סינון ספין (כמתואר לעיל). אוריגמי ה-DNA היה מעורבב עם ה-NoVLPs בריכוזים שונים ביחס של 1:4 (v/v), וכתוצאה מכך ריכוז אוריגמי סופי של 6 ננומטר (30 μl דגימות). הדגימות הועברו לכוסות דיאליזה של 3.5 kDa MWCO (Slize-A-Lyzer, Thermo Scientific) ועברו דיאליזה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס כנגד 50 mM Tris-HCl, pH 8.9. לצורך הרכבה מחדש, הדגימות עברו דיאליזציה, בשלב שני, למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס כנגד חיץ נתרן פוספט של 100 mM, pH 6.0, בדומה לדיווח של White וחב'.64 המורכבות במהלך הפירוק וההרכבה של ה-NoVLPs נותחה על ידי AGE ו-TEM.
מורכבות של אוריגמי DNA ו-SV40 CPs
ה-SV40 major CP VP1 (abcam, ab74565) פורק והורכב מחדש (מותאם מ-ref. 50) על ידי דיאליזה של ה-VLPs המורכבים ב-PBS כנגד 20 מ"מ Tris, 2 מ"מ DTT, 5 מ"מ EDTA ו-50 מ"מ NaCl, pH 8.9 למשך 2 שעות ב-4 מעלות צלזיוס (3.5 kDa MWCO, Slize-A-Lyzer, Thermo Scientific), לאחר שריכוז ה-EDTA ירד על ידי שלב דיאליזה נוסף ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כנגד 2 מ"מ Tris, 20 מ"מ DTT, 2 מ"מ EDTA ו-2 מ"מ NaCl, pH 50. הריכוז נקבע על סמך הספיגה ב-8.9 ננומטר (מקדם הכחדה VP280, 1 M-1 cm-1). אוריגמי ה-DNA הועבר למאגר 100 מ"מ HEPES, pH 7.2, בתוספת 125 מ"מ NaCl על ידי סינון ספין (כמתואר לעיל). החלבונים עורבבו עם אוריגמי ה-DNA ביחס של 1:1 (v/v) כדי להגיע לריכוזים סופיים של 0-20 מיקרומטר ו-2 ננומטר, בהתאמה, והדגימות הודגרו במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר לפני ניתוח באמצעות AGE ו-TEM .
מורכבות של אוריגמי DNA ו-MPyV CPs
להרכבת קפסומרים VP1 (לביטוי וטיהור רקומביננטי, ראה הערה משלימה 23) ואוריגמי DNA, מבני האוריגמי הועברו לראשונה לתוך חיץ טריס 40 מ"מ, pH 8.0, בתוספת של 20 מ"מ חומצה אצטית, 2 מ"מ EDTA ו-12 מ"מ MgCl2 באמצעות סינון ספין (ראה לעיל). בהתאם לעודף החלבונים הרצוי, ε, הקפסומרים הודללו לתוך 'מאגר אחסון', המכיל 40 מ"מ טריס, 200 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EDTA, 5% (v/v) גליצרול ו-5 מ"מ DTT, pH 8.0. עבור הקומפלקס, קפסומרי VP1 הודללו ביחס של 1:20 בתמיסת האוריגמי, וכתוצאה מכך ריכוז אוריגמי סופי של 0.75 nM (דגימות 30 μl) ומאגר מורכב המכיל 40 mM Tris, 19 mM חומצה אצטית, 1.95 mM EDTA, 11.4 מ"מ MgCl2, 10 mM NaCl, 0.25% (v/v) גליצרול ו-0.25 mM DTT, pH 8. תגובת הקומפלקס הודגרה ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני הניתוח עם AGE ו-TEM.
AFM
טיפה של 20 μl של תמיסת אוריגמי RNA-10HB 6 ננומטר (MgCl2 ריכוז מותאם ל-12.5 מ"מ) הופקד על מצע נציץ טרי (Electron Microscopy Sciences) למשך דקה אחת, ולאחר מכן שלושה שלבי שטיפה עם 1 μl מים מפושטים שנמחקו מיד. המדגם יובש תחת זרם חנקן יציב והצטלם מיד לאחר הכנת הדגימה. תמונות AFM נרכשו באוויר באמצעות ScanAsyst במצב אוויר יחד עם בדיקות ScanAsyst-Air (Bruker) על AFM של Dimension Icon (Bruker). עיבוד תמונה בוצע ב-NanoScope Analysis v.100 (Bruker).
TEM
דגימות אוריגמי DNA רגילות (4 ננומטר) הוכנו על ידי דגירה של טיפת 3 μl למשך 3 דקות על רשת נחושת מצופה פחמן של Formvar (FCF20Cu, Electron Microscopy Sciences) מנוקה (400 שניות חמצן פלזמה הבזק, Gatan Solarus) לאחר מכן נספג על נייר סינון והוכתם שלילי. עבור דגימות מורכבות CCMV-CP (אוריגמי DNA של 4 ננומטר), טיפת 3 μl הופקדה על הרשת למשך 1.5 דקות. לאחר ספיגה על נייר סינון, הרשת נטבלה בטיפה של 10 μl של חיץ מורכב (3.25 מ"מ HEPES-NaOH, 25 מ"מ Tris-HCl, 150 מ"מ NaCl, 0.5 מ"מ DTT) למשך 5 שניות. עבור דגימות עם ריכוזי אוריגמי DNA ≤2 nM (לדוגמה, קומפלקס עם SV40, MPyV), ועבור דגימות המכילות RNA-6HB (ריכוז אוריגמי 7.5 nM), גודל הטיפות הוגדל ל-5 μl וזמן הדגירה הוארך ל-5 דקות . צביעה שלילית65 בוצע על ידי טבילה ראשונה של הרשת בטיפה של 5 μl של תמיסת אורניל פורמט מימית 2% (w/v) (בתוספת 25 mM NaOH להתאמת pH), שנמחקה מיד. לאחר שלב זה טבילה בטיפה של 20 μl, שהודגרה על הרשת למשך 45 שניות. לאחר שלב הסופג האחרון, הדגימות הושארו לייבוש לפחות 20 דקות לפני שההדמיה בוצעה במיקרוסקופ FEI Tecnai 12 Bio-Twin במתח האצה של 120 V.
Cryo-EM
הדגימות עבור cryo-EM הוכנו באמצעות מנגנון ויטריפיקציה (Vitrobot, Thermo Fisher Scientific). ריכוזי האוריגמי בדגימות המורכבות היו 90 ננומטר עבור 6HB-2k, 84 ננומטר עבור 24HB-2.5k, 18 ננומטר עבור 6HB-10k ו-21 ננומטר עבור 24HB-10k, וכתוצאה מכך ריכוזי CP הכוללים של 180 מיקרומטר מורכבים ו-210 מיקרומטרים מורכבים. דגימות 6HB ו-24HB, בהתאמה. מנה של 3 μl של דגימת האוריגמי המורכבת הופקדה על רשת מצופה פחמן (נחושת 50 רשת R002/200, Quantifoil) שנוקה בפלזמה (1.2 שניות, Harrick Plasma PDC-1.3-EC מכשיר). לאחר דגירה של דקה אחת, נוזל עודף נמחק למשך 1 שניות ב-10% לחות יחסית ו-100 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן צלילה של הרשת לתוך אתאן נוזלי. הרשתות אוחסנו בחנקן נוזלי. הנתונים נאספו בטמפרטורת חנקן נוזלי במיקרוסקופ אלקטרוני תמסורת של Talos Arctica (Thermo Fisher Scientific) המופעל ב-6 קילוואט, באמצעות גלאי אלקטרונים ישיר של Falcon III (Thermo Fisher Scientific). נעשה שימוש בהגדלה של 200×, וכתוצאה מכך גודל פיקסל מכויל של 150,000 Å. פרמטרי איסוף הנתונים מפורטים בטבלה משלימה 4 (הערה משלימה 24).
שחזור של חלקיקים בודדים
נתוני Cryo-EM עובדו באמצעות CryoSPARC 3.3.2 (Structura Biotechnology) אלא אם צוין אחרת. פרמטרי פונקציית העברת ניגודיות נאמדו באמצעות CTFFIND4 (ר'. 66). מקטעים לאורך חוטים הוגדרו באמצעות הפונקציה Filament Tracer. פרמטרי סימטריה סליל נאמדו בתחילה מממוצעי מחלקות דו-ממדיות באמצעות Helix Indexer מבוסס Python67. פרמטרי המבנה והסימטריה הסלילית שוכללו באמצעות פונקציית Helix Refine ועידון לא אחיד על מקטעי סליל מתוקנים בתנועה. כדי לקבוע את פרמטרי הסימטריה הסלילית של השכבה החיצונית 6HB-10k, בוצעה ריצת סיווג דו-ממדית שניה לאחר הפחתת התרומה של השכבה הפנימית באמצעות פונקציית חיסור החלקיקים. ה- Helix Refine הופעל על תת-קבוצת החלקיקים שהראתה שכבה שנייה ברורה, תוך שימוש בפרמטרי הסימטריה שנקבעו כהערכות ראשוניות. שחזורים חודדו על ידי יישום אד-הוק B-פקטור של −300 Å2. השחזורים נקבעו בממוצע במרחב האמיתי על ידי הטלת פרמטרי סימטריה סליל על החלק המרכזי והמסודר ביותר של המפה (50% מהנפח) בבסופט68.
לצורך מודלים של מבנה הקפסומר, מונומר CP (PDB:1cwp) הותקן בשחזור 6HB-2k בששת המיקומים של ההקסאמר כגופים קשיחים ב-UCSF ChimeraX 1.3 (ר'. 69). המודל האטומי שוכלל כנגד הצפיפות באמצעות ISOLDE 1.3 (ר'. 70) ו-Penix 1.19 (ר'. 71). כדי ליצור ייצוגים אטומיים של החוטים, נוצרו עותקי סימטריה של ההקסאמר ב-ChimeraX. כדי לדמיין את המיקום של CP hexamers ו-pentamers בכובע, הכובעים של נימה 6HB-2k נבחרו ידנית בצילומי המיקרו. מבנה הכובע שוכלל באמצעות פונקציית Helix Refine תוך השמטת סימטריה, מכיוון שהדבר אפשר להגביל את זווית ההטיה של הכובעים קרוב למבטים מהצד. שחזור המכסה סונן לרזולוציה המקומית שלו באמצעות מסנן מקומי. המודל האטומי ההקסאמר ומבנה הפנטאמר שנקבע בעבר (שחולץ מ-PDB:1cwp לאחר יישום סימטריה איקוסהדרלית) הותאמו כגופים קשיחים ב-ChimeraX 1.3. פרמטרים של עיבוד נתונים ניתנים בטבלה משלימה 4. פרמטרי חידוד ותיקוף של מודל מוצגים בטבלה משלימה 5.
SAXS
הדגימות עבור SAXS הוכנו בריכוזי אוריגמי של 165 ננומטר (6HB, המקביל לריכוז CP מפורק של 330 מיקרומטר) ו-180 ננומטר (24HB, המתאים לריכוז CP מפורק של 450 מיקרומטר) ונאטמו בקוטר של 1.5 מ"מ. נימי זכוכית. המדידות בוצעו באמצעות מכשיר Xenocs Xeuss 3.0C המצויד במקור מיקרופוקוס נחושת 3D GeniX (אורך גל λ = 1.542 Å) וגלאי פיקסלים היברידי EIGER2 R 1M במרחק דגימה-גלאי של 1,100 מ"מ. רכישת נתונים בוצעה במשך 3 × 3 שעות לכל דגימה. כדי להשיג את נתוני ה-1D SAXS, נתוני הפיזור הדו-ממדי נמדדו בצורה אזימוטית. גודל וקטור הפיזור q ניתן ע"י (q,=,4uppi sin theta /lambda) עם 2θ בהיותה זווית הפיזור. הטיפול בנתונים כלל ממוצע של נתוני הדו-ממד המשולש של כל דגימה, חיסור רקע ממאגר המורכבות (2 מ"מ HEPES-NaOH, 3.25 מ"מ Tris-HCl, 25 מ"מ NaCl, 150 מ"מ DTT) ופורמט הותקן לצילינדר ( 0.5HB, 6HB), כדורים (T = 3 מכלולי CPs icosahedral) וצילינדר ליבה-מעטפת (6HB-2k, 24HB-2.5k) באמצעות תוכנת SasView. דגם Debye-Anderson-Brumberger נוסף כדי לתת את הדעת על הרקע.
- הפצת תוכן ויחסי ציבור מופעל על ידי SEO. קבל הגברה היום.
- PlatoData.Network Vertical Generative Ai. העצים את עצמך. גישה כאן.
- PlatoAiStream. Web3 Intelligence. הידע מוגבר. גישה כאן.
- PlatoESG. רכב / רכבים חשמליים, פחמן, קלינטק, אנרגיה, סביבה, שמש, ניהול פסולת. גישה כאן.
- BlockOffsets. מודרניזציה של בעלות על קיזוז סביבתי. גישה כאן.
- מקור: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01443-x
- :יש ל
- :הוא
- ][עמ'
- 1
- 1: יחס 1
- 1.3
- 10
- 100
- 11
- 116
- 12
- 14
- 15%
- 16
- 180
- 19
- 1M
- 2%
- 20
- 200
- 2011
- 2014
- 2015
- 2018
- 2019
- 2021
- 2022
- 2023
- 23
- 24
- 25
- 27
- 2D
- 30
- 31
- 32
- 3d
- 40
- 46
- 50
- 500
- 60
- 65
- 66
- 67
- 7
- 70
- 75
- 8
- 80
- 84
- 9
- 90
- a
- מֵעַל
- האצה
- חֶשְׁבּוֹן
- מדויק
- נרכש
- רכישה
- Ad
- מותאם
- הוסיף
- תוספת
- נוסף
- בנוסף
- מותאם
- התאמה
- לאחר
- נגד
- גיל
- סוֹכֵן
- AIR
- AL
- מותר
- לאורך
- an
- אנליזה
- עוגן
- ו
- מריחה
- מתקרב
- ARE
- סביב
- AS
- התאסף
- עצרת
- At
- ממוצעת
- רָחוֹק
- רקע
- מבוסס
- BE
- היה
- לפני
- להיות
- בֵּין
- כריכה
- ביוטכנולוגיה
- גופים
- שניהם
- BP
- בקצרה
- חיץ
- בִּניָן
- by
- CAN
- כּוֹבַע
- כמוסות
- תאים
- תאי
- מֶרכָּזִי
- ערוץ
- בחירה
- בכיתה
- מיון
- ברור
- קליק
- סְגוֹר
- אוסף
- תחרותי
- ריכוז
- תנאים
- מכיל
- נמשך
- לעומת זאת
- תרומה
- נשלט
- עותקים
- נְחוֹשֶׁת
- תוֹאֵם
- לִיצוֹר
- נוצר
- נתונים
- עיבוד נתונים
- מוגדר
- מסירה
- צפיפות
- תלוי
- שהופקדו
- מְתוּאָר
- מעוצב
- רצוי
- לקבוע
- נחוש
- מפתחים
- מכשיר
- דיאליזה
- אחר
- מֵמַד
- ישיר
- מרחק
- ה-DNA
- מטה
- לייבש
- בְּמַהֲלָך
- דינמי
- e
- E&T
- כל אחד
- ed
- מחנכים
- השפעה
- סוף
- הנדסה
- לְהַבטִיחַ
- סביבה
- שווה
- מְצוּיָד
- מוערך
- הערכות
- Ether (ETH)
- דוגמה
- עודף
- חליפין
- החליפו
- ביטוי
- הכחדה
- גורם
- בז
- מהר
- פיי
- לסנן
- מסננים
- סופי
- מציאת
- ראשון
- פלאש
- בעקבות
- בעד
- טופס
- התהוות
- ארבע
- החל מ-
- פונקציה
- יתר על כן
- נתן
- זכוכית
- בהדרגה
- רֶשֶׁת
- צמיחה
- הנחיות
- היה
- כאן
- גָבוֹהַ
- אולם
- HTTPS
- היברידי
- i
- קרח
- ICON
- ג
- תמונה
- תמונות
- הדמיה
- מיד
- שָׁקוּעַ
- טְבִילָה
- כופה
- in
- כלול
- גדל
- דגירה
- דגירה
- מַפתְחָן
- בתחילה
- בהתחלה
- מכשיר
- משולב
- אינטראקציה
- מִמְשָׁק
- אל תוך
- יונית
- מְבוּדָד
- IT
- שֶׁלָה
- KDA
- שכבה
- הכי פחות
- עזבו
- אוֹר
- קשר
- נוזל
- ברשימה
- טוען
- מקומי
- גדול
- באופן ידני
- מַפָּה
- מפות
- חוֹמֶר
- נמדד
- מידות
- מדידת
- רשת
- שיטות
- נָצִיץ
- מיקרוסקופ
- מיקרוסקופיה
- דקות
- מעורב
- תַעֲרוֹבֶת
- ניידות
- מצב
- מודל
- דוּגמָנוּת
- מודולרי
- MOL
- מולקולרי
- ניטור
- רוב
- mRNA
- ננו
- ננוטכנולוגיה
- טבע
- שלילי
- להשיג
- of
- on
- מופעל
- אופטימיזציה
- אַחֶרֶת
- תוֹצָאָה
- בין לילה
- חמצן
- מאמר
- פרמטרים
- חלק
- חלקיק
- PBS
- PCR
- עבור
- ביצעתי
- פיזית
- הרים
- גובה הצליל
- פיקסל
- הַצָבָה
- פלזמה
- פלטפורמה
- אפלטון
- מודיעין אפלטון
- אפלטון נתונים
- צולל
- עמדות
- הכנה
- מוּכָן
- להציג
- קוֹדֶם
- תחל
- PROC
- נהלים
- מעובד
- תהליך
- תָכְנִית
- .
- חֶלְבּוֹן
- חלבונים
- נרכש
- איכות
- טִוּוּחַ
- יחס
- לְהַגִיעַ
- הגעה
- תגובה
- ממשי
- מציאותי
- Red
- לחדד
- מעודן
- בדבר
- קרוב משפחה
- חזר
- דווח
- נדרש
- חוקרים
- החלטה
- בהתאמה
- וכתוצאה מכך
- תוצאות
- נוקשה
- רנ"א
- חֶדֶר
- הפעלה
- s
- מלח
- SCI
- מדעים
- מדעי
- שְׁנִיָה
- לִרְאוֹת
- מגזרים
- משמרת
- קצר
- הראה
- הראה
- צד
- באופן דומה
- אתר
- שישה
- מידה
- קטן יותר
- נתרן
- תוכנה
- פִּתָרוֹן
- פתרונות
- מָקוֹר
- מֶרחָב
- לפצל
- אמור
- יציב
- שלב
- צעדים
- מניות
- אחסון
- מאוחסן
- קווצות
- זרם
- כוח
- מִבְנֶה
- מחקרים
- לימוד
- כתוצאה מכך
- מוצלח
- מערכת
- שולחן
- טאלוס
- טכנולוגיות
- זֶה
- השמיים
- שֶׁלָהֶם
- אז
- תטא
- זֶה
- שְׁלוֹשָׁה
- דרך
- זמן
- פִּי
- ל
- יַחַד
- כלי
- סה"כ
- לצייר
- להעביר
- הועבר
- טיפול
- תור
- שתיים
- תחת
- ארה"ב
- להשתמש
- מְשׁוּמָשׁ
- משתמש
- ממשק משתמש
- באמצעות
- תרכיב
- לְאַמֵת
- אימות
- רב צדדי
- נופים
- וירוס
- ראיה
- מתח
- כֶּרֶך
- כרכים
- W
- היה
- כביסה
- מים
- מִשׁקָל
- היו
- אשר
- לבן
- עם
- בתוך
- לְלֹא
- X
- תשואות
- זפירנט