Di Vivo Pelacakan Partikel Emisi Positron Real-time (PEPT) Dan PET Partikel Tunggal - Nanoteknologi Alam

Diterbitkan Ulang Oleh Plato

Followers: 0

Semua reagen digunakan saat diterima kecuali dinyatakan lain. Semua bahan kimia dibeli dari Sigma Aldrich kecuali manik-manik penghitung (CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen). ζ-Potensi diukur menggunakan Zetasizer NanoZS90 (Malvern Instruments). Ukuran dan morfologi partikel dipelajari oleh SEM dalam mikroskop JEOL JSM 7800F Prime dengan EDS terintegrasi untuk menyediakan analisis unsur. Ukuran partikel ditentukan dengan mengukur 50 partikel independen. Kromatografi lapis tipis radio instan (ITLC) dikembangkan pada kertas kromatografi mikrofiber kaca Agilent Technologies yang diresapi dengan asam silikat dan dianalisis menggunakan pemindai TLC Lablogic Flow-count dan detektor tabung fotomultiplier (PMT) BioScan B-FC-3200 menggunakan perangkat lunak Laura. Fase gerak ITLC terdiri dari 0.175 M asam sitrat dan 0.325 M trisodium sitrat dalam air kecuali dinyatakan lain. Sampel radioaktif diukur menggunakan Capintec CRC-25R (Capintec) atau LKB Wallac 1282 Compugamma CS (PerkinElmer) yang datanya dikumpulkan menggunakan perangkat lunak EdenTerm. Eksperimen aliran sitometri dilakukan dalam penyortir sel BD FACSMelody menggunakan Perangkat Lunak BD FACSChorus. Gambar PET/CT diperoleh menggunakan pemindai NanoPET/CT (Mediso), direkonstruksi menggunakan perangkat lunak Nucline v.0.21, dan gambar dianalisis menggunakan perangkat lunak VivoQuant (versi 3.5, InviCRO). Data mode daftar diperoleh dengan perangkat lunak MATLAB khusus yang dikembangkan oleh Mediso. Autoradiografi dilakukan dalam instrumen GE Amersham Typhoon.

Sintesis partikel silika berukuran sub-mikrometer

Partikel-partikel tersebut disintesis menggunakan metode Stöber. Metode ini didasarkan pada hidrolisis dan kondensasi silikon alkoksida berturut-turut untuk menghasilkan partikel silika bulat monodisperse.²⁷. Tetraethyl orthosilicate (TEOS) digunakan sebagai sumber silikon, amonia sebagai katalis basa dan kalium klorida sebagai elektrolit. Larutan TEOS dalam etanol terus ditambahkan ke larutan yang mengandung katalis dan elektrolit. Modifikasi kuantitas awal reagen atau laju penambahan memberikan perbedaan dalam ukuran partikel seperti yang dilaporkan sebelumnya²⁸. Di sini, dua larutan disiapkan sebelum sintesis partikel: Larutan 1 mengandung 19.0 mmol TEOS dalam 33.3 ml EtOH dan Larutan 2 mengandung 0.23 mmol KCl dalam 9 ml amonia, 65 ml EtOH dan 6.75 ml H₂O. Untuk sintesis, Larutan 2 ditempatkan dalam labu alas bulat 250 ml yang dipanaskan pada suhu 50 °C sambil diaduk pada 300 rpm selama 15 menit. Kemudian, Larutan 1 ditambahkan tetes demi tetes ke Larutan 2 (laju suplai 0.2 ml menit^-1). Setelah penambahan Larutan 1, partikel yang diperoleh dimurnikan dengan sentrifugasi pada suhu 18,300g selama 3 menit dan dicuci dengan EtOH lima kali. Terakhir, SiO₂ mikropartikel dikeringkan dalam kondisi vakum.

Mencangkok partikel berukuran sub-mikrometer dengan silan–PEG_5k

20 mg ml^-1 larutan silan-PEG_5k (Sigma Aldrich) dalam EtOH 98% ditambahkan melalui larutan smSiP pada 5 mg ml^-1 dalam EtOH 98% dan 2.8% amonia. Campuran diaduk semalaman pada suhu kamar, dan partikel diperoleh kembali dengan sentrifugasi pada suhu 18,300g selama 3 menit. Terakhir, partikel dicuci tiga kali dengan air suling dan dikeringkan dalam vakum semalaman. Larutan pencuci dibekukan-kering semalaman dan jumlah silan-PEG yang tidak terikat_5k ditimbang untuk perhitungan hasil reaksi. 0.05 mg ml^-1 solusi smSiP – PEG_5k dalam air suling digunakan untuk reaksi radiolabelling lebih lanjut.

[⁶⁸Ga]GaCl₃

Gallium-68 dielusi sebagai [⁶⁸Ga]GaCl₃ dari Eckert dan Ziegler ⁶⁸Ge /⁶⁸Generator Ga dalam HCl ultra murni (4 ml, 0.1 M) diproduksi sesuai persyaratan praktik manufaktur yang baik (ABX).

Konsentrasi [⁶⁸Ga]GaCl₃ elusi dengan pertukaran kation

Konsentrasi elusi dilakukan menggunakan pengaturan yang dijelaskan pada Gambar Tambahan. 1. Pertama, 4 ml [⁶⁸Ga]GaCl₃ elusi dimasukkan ke dalam kartrid Strata-XC 33u (Phenomenex) dan eluatnya dibuang. Kemudian, kartrid dicuci dengan 5 ml larutan aseton/0.1 M HCl (80:20) dan eluatnya dibuang. Akhirnya, [⁶⁸Ga]GaCl₃ dikumpulkan dengan menambahkan 700 µl larutan aseton/0.05 M HCl (98:2), dikeringkan di bawah suhu N₂ dialirkan dan diresuspensi dalam 50 µl buffer HEPES 0.5 M, (pH 4.9). Radio-TLC dilakukan pada tahapan yang berbeda untuk pengendalian kualitas. Protokol ini membutuhkan waktu sekitar 20 menit untuk memberikan hasil pemulihan sebesar 86.2 ± 8.5%.

Radiolabelling partikel silika pada konsentrasi berbeda dengan ⁶⁸Ga

Partikel silika diresuspensi pada konsentrasi yang berbeda (dari 1 hingga 0.002 mg ml^-1) dalam buffer HEPES 0.5 M (pH 4.9). Kemudian, 50 µl larutan ditambahkan ke dalam tabung reaksi sebelum penambahan pekat [⁶⁸Ga]GaCl₃ elusi dalam 50 µl buffer HEPES 0.5 M (pH 4.9). Reaksi dilakukan pada suhu 90 °C selama 30 menit, dan radio-TLC dilakukan untuk menghitung hasil radiokimia.

Pengukuran konsentrasi partikel dengan flow cytometry

Konsentrasi partikel dihitung dengan flow cytometry menggunakan manik-manik penghitung (CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen) mengikuti instruksi pabrik. Partikel silika diresuspensi pada 0.05 mg ml^-1, disonikasi selama 10 menit dan melewati filter ukuran potong 10 µm (Filter Jarum Suntik KX, Nilon, 25 mm, 10 µm). Manik-manik Penghitung Absolut CountBright dihangatkan hingga suhu kamar dan divorteks selama 30 detik. Kemudian, 50 µl manik-manik ditambahkan ke 300 µl partikel silika dan campuran divorteks selama 30 menit untuk mendapatkan larutan homogen. Sampel dijalankan pada flow cytometer dan ambang batas hamburan ke depan (FSC) ditetapkan untuk memasukkan manik-manik dan partikel pada plot sebar sisi linier versus FSC linier. Setelah itu, tegangan detektor fluoresensi disesuaikan untuk penghitungan manik-manik dan strategi gerbang dilakukan untuk mengisolasi partikel silika dan populasi penghitungan manik-manik. Akhirnya, gerbang pada partikel dan penghitungan absolut manik digambar dan 1,000 peristiwa manik dicatat untuk setiap sampel. Dengan menggunakan strategi ini, jumlah partikel dalam larutan dihitung menggunakan persamaan berikut:

$$begin{array}{l}displaystyle{mathrm{Absolute}},{mathrm{count}},left(frac{mathrm{Partikel}}{{{upmu l}}}kanan)=displaystylefrac{({mathrm{ Partikel}},{mathrm{count}},kali,{mathrm{Menghitung}},{mathrm{beads}},{mathrm{volume}})}{({mathrm{Menghitung}},{mathrm{beads}} ,{mathrm{count}},kali,{mathrm{Partikel}},{mathrm{volume}})} kali,{mathrm{Menghitung}},{mathrm{beads}},{mathrm{concentration}}kiri(frac {{mathrm{Beads}}}{{{upmu l}}}kanan)end{array}$$

Radiolabelling 500 smSiP

Lima ratus smSiP ditambahkan ke 50 µl larutan pekat [⁶⁸Ga]GaCl₃ elusi dalam buffer HEPES 0.5 M pH 4.9. Kemudian, 5.6 µl polisorbat 80 ditambahkan dan campuran dipanaskan pada 90 °C selama 30 menit pada 900 rpm dalam mixer termal. Setelah itu, protokol pemurnian multi-langkah akhir dirancang untuk menghilangkan yang tidak bereaksi/koloid ⁶⁸Ga Lima puluh mikroliter 10 mM EDTA ditambahkan, dan campuran diinkubasi 5 menit pada suhu kamar. Kemudian, partikel disentrifugasi selama 3 menit pada suhu 18,300g, diresuspensi dalam 500 µl PBS yang mengandung 1 mM EDTA + 0.1% polisorbat 80 dan divorteks perlahan selama 10 detik. Partikel disentrifugasi lagi, dicuci dengan larutan 0.1 mM EDTA + 0.1% polisorbat 80 dalam PBS dan divorteks perlahan selama 10 s. Terakhir, partikel disentrifugasi dan dicuci lima kali lagi dengan PBS + 0.1% polisorbat 80 dan disuspensikan kembali dalam 500 µl PBS. Reaksi radiolabelling dipantau oleh radio-TLC selama langkah-langkah reaksi berturut-turut untuk mengevaluasi keberadaan koloid (yang dapat tertukar dengan partikel jika tidak dihilangkan dengan benar), radiolabelling partikel dan kemurnian produk akhir. RLY dihitung dengan perbandingan antara jumlah radioaktivitas dalam partikel dan supernatan setelah tahap pencucian.

Fraksinasi

Untuk strategi fraksinasi, volume dari 0.5 µl hingga 20 µl dari ⁶⁸Ga-smSiP pada konsentrasi teoritis 1 partikel µl^-1 ditambahkan ke dalam tabung sampel yang berbeda dalam langkah 1 µl (0.5, 1, 2, 3…) dan PBS ditambahkan hingga volume akhir menjadi 50 µl. Kemudian, 37.5 µl dari tabung pertama dipipet ke tabung sampel kedua, 25 µl tabung kedua ke tabung ketiga dan terakhir 12.5 µl tabung ketiga ke tabung keempat. Strategi ini menyediakan empat tabung per sampel dengan volume akhir 12.5 µl per tabung. Radioaktivitas di setiap tabung diukur dalam penghitung gamma dan nilainya dihitung dalam kBq menggunakan kurva kalibrasi, untuk perbandingan dan analisis lebih lanjut. Sampel yang mengandung sebagian besar radioaktivitas hanya dalam satu tabung disonikasi selama 30 detik pada suhu kamar dan dilakukan tahap fraksinasi kedua. Kemudian, sampel yang semua radioaktivitasnya ditemukan dalam satu tabung (dengan aktivitas yang dapat diabaikan di tiga tabung lainnya) digunakan untuk percobaan in vivo/ex vivo lebih lanjut.

Pencitraan hantu PET/CT

Eksperimen pencitraan hantu dilakukan dengan salah satunya ⁶⁸Ga-smSiP. Kanula digunakan untuk memasukkan partikel ke dalam tabung sampel untuk mengevaluasi apakah satu partikel dapat tetap terperangkap di dalam tabung kanula selama pemberian. Secara singkat, tabung hantu ditempatkan di pemindai nanoPET/CT dengan ujung ujung kanula menempel pada tabung. Setelah memulai perolehan PET, partikel yang diresuspensi dalam 100 µl PBS dikirimkan dengan jarum suntik insulin yang dipasang di awal kanula. Kemudian, kanula dicuci dengan 50 µl PBS untuk memastikan pengiriman partikel ke dalam tabung hantu. Akuisisi PET dilakukan selama 2 jam diikuti dengan CT scan standar.

Pencitraan PET / CT in vivo

Studi pencitraan hewan ditinjau secara etis dan dilakukan sesuai dengan Undang-Undang Hewan (Prosedur Ilmiah) 1986 (ASPA) Peraturan Kantor Pusat Inggris yang mengatur eksperimen hewan. Pencitraan in vivo dilakukan pada tikus BALB/c sehat berumur 8 minggu. Hewan dibius dengan isofluran (2-3% dalam oksigen), dikanulasi dan ditempatkan di tempat pemindai di bawah anestesi. Tempat tidur dipanaskan hingga 37 °C oleh aliran udara internal untuk menjaga hewan pada suhu tubuh normal, dan laju pernapasan dipantau dan dipertahankan pada 60–80 napas menit.^-1 sepanjang pemindaian. Mempertahankan kendali terhadap suhu hewan adalah hal yang penting, karena penurunan suhu yang tidak terduga dapat menyebabkan penurunan kecepatan partikel dalam darah. Satu ⁶⁸Ga-smSiP (n = 4) atau ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k partikel (n = 2) diberikan melalui kanula dalam 100 µl PBS, diikuti dengan pencucian dengan 50 µl PBS setelah memulai perolehan PET (mode kebetulan 1:5; jendela waktu kebetulan 5 ns). PET direkam selama 2 jam, dan kemudian dilakukan CT scan setengah lingkaran. Suhu tubuh hewan dan laju pernapasan dipantau selama seluruh proses. Gambar PET/CT dinamis direkonstruksi menggunakan rekonstruksi 3D Tera-Tomo (jendela energi 400–600 keV, mode kebetulan 1:5, 20 iterasi, dan 1 subset) pada ukuran voxel 0.4 × 0.4 × 0.4 mm³ dan dikoreksi untuk redaman, hamburan, dan peluruhan. Data mode daftar untuk semua akuisisi PET/PEPT dapat ditemukan ⁶⁸Ga-smSiP di ref. ²⁹ dan untuk ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k di ref. ³⁰.

Pelacakan waktu nyata

Pertama, data diekspor dari pemindai dalam format mode daftar (yaitu, format dengan stempel waktu dan indeks kristal untuk foton kebetulan yang terdeteksi). Transformasi geometri diterapkan untuk mengubah indeks kristal ke posisi dalam satuan mm. Metode Birmingham menghitung MDP secara berulang dari sebagian LoR. Hal ini dilakukan dengan membuang LoR yang jaraknya lebih jauh dari jarak yang ditentukan dari MDP karena LoR kemungkinan besar muncul dari LoR yang salah, misalnya LoR yang mungkin berasal dari pencar. MDP disempurnakan dengan setiap iterasi; jumlah iterasi secara efektif diatur oleh f-faktor dan berkaitan dengan jumlah total LoR yang digunakan untuk memperkirakan posisi partikel akhir dalam subset tersebut (misalnya, sebuah f-faktor 0.5 berarti loop iterasi akan berakhir ketika 50% LoR di subset tersisa). Jumlah LoR yang digunakan dalam suatu subset dapat dikurangi untuk meningkatkan pengambilan sampel temporal (subset tersebut berurutan dalam waktu tanpa tumpang tindih) dengan mengorbankan peningkatan ketidakpastian posisi (rincian algoritma lebih lanjut dapat ditemukan di Parker dkk.⁵) Metode Birmingham digunakan untuk menganalisis data mode daftar dari pemindai PET. Ukuran sampel adaptif digunakan untuk melacak partikel pada tikus. Ukuran sampel ditetapkan untuk mencapai keseimbangan pengambilan sampel temporal yang memadai sekaligus meminimalkan kesalahan posisi. Ukuran sampel antara 100 dan 200 LoR digunakan pada tahap awal pemindaian (<60 s dari awal pemindaian), dengan f = 0.1, menghasilkan interval sekitar 1–5 s. Pada waktu pemindaian >60 s, ukuran sampel divariasikan antara 1,000 dan 2,000, yang menghasilkan interval waktu antara 30 s dan 60 s tergantung pada eksperimen in vivo. Jumlah penghitungan yang digunakan untuk menghitung MDP (pada iterasi akhir) dapat ditemukan dengan mengalikan ukuran sampel dengan f-nilai faktor. Parameter ini didasarkan pada pengalaman sebelumnya dan berdasarkan publikasi sebelumnya¹.

Kecepatan diperoleh sebagai (akar{{v}_{x}^{2}+{v}_{y}^{2}+{v}_{z}^{2}}) dimana ({v}_{m}^{2}) adalah kecepatan di x, y dan z arah.

Pengambilan organ secara ex vivo

Penyerapan di berbagai organ dievaluasi dengan penghitungan gamma. Setelah pencitraan PET/CT in vivo, hewan dibunuh dengan dislokasi serviks dan organnya dipotong serta ditimbang untuk penghitungan radioaktivitas dalam penghitung gamma (LKB Wallac 1282 Compugamma CS). Data dinyatakan sebagai persentase dosis yang disuntikkan (dosis dalam organ/dosis total yang disuntikkan) per gram jaringan (%ID g^-1).

Autoradiografi

Radioaktivitas di paru-paru dilacak dengan detektor radiasi (probe EP15, Morgan), dan paru-paru dipotong menjadi beberapa bagian kecil dengan pisau bedah sampai diperoleh sebagian kecil jaringan dengan sinyal radioaktif. Jaringan dibekukan dalam isopropanol bersuhu −80 °C. Segera setelah pembekuan, jaringan ditanam dalam media suhu pemotongan optimal dan dipotong dalam cryostat dalam irisan berukuran 20 µm. Setiap irisan disurvei dengan detektor hingga irisan radioaktif ditemukan. Irisan sebelumnya (di bawah latar belakang), radioaktif dan berikutnya (di bawah latar belakang) ditempatkan pada slide mikroskop Superfrost (Epredia). Sisa jaringan yang tersisa juga berada di bawah latar belakang. Slide mikroskop dengan tiga bagian ditutup dengan cling film dan ditempelkan pada pelat autoradiografi GE semalaman. Pelat tersebut dianalisis menggunakan GE Amersham Typhoon dengan resolusi 25 µm dan pengaturan PMT 4,000. Gambar autoradiografi ditumpangkan pada gambar jaringan, menunjukkan satu titik radioaktivitas pada potongan radioaktif. Untuk kuantifikasi, standar disiapkan dalam aktivitas berbeda yang diketahui, dan masing-masing standar dicatat sebagai kuintet 1 µl di kertas. Bintik-bintik tersebut diinkubasi dalam layar penyimpanan fosfor yang sama, BAS-IP MS (Standar Multiguna) dari GE saat partikel tunggal diukur. Gambar diperoleh dengan Amersham Typhoon 5 dengan Control Software versi 2.0 dalam mode fosfor dengan ukuran piksel 100 µm dan sensitivitas 4,000. Gambar dikuantifikasi dengan perangkat lunak ImageQantTL v10.0-261 menggunakan kotak alat kuantifikasi gel. Bintik-bintik tersebut dikoreksi dengan memilih wilayah tepat sebelum atau sesudah titik tersebut sebagai latar belakang yang konstan. Volume titik yang dihasilkan digunakan untuk menghitung Bq dalam partikel berdasarkan kurva kalibrasi.

Statistik dan reproduktifitas

Untuk analisis kuantitatif, minimal tiga ulangan biologis dianalisis tidak termasuk data in vivo ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k (n = 2). Data dianalisis dengan analisis varians satu arah biasa (ANOVA) dengan uji perbandingan berganda Dunnett dan uji Student. t-tes. A P nilai <0.05 dianggap signifikan secara statistik.