Capteurs de lymphocytes T multispécifiques programmables à base d'origami d'ADN - Nature Nanotechnology

Toutes les expériences et conditions expérimentales décrites tout au long de cette étude sont conformes aux règles éthiques établies par le comité d'examen institutionnel de la faculté de médecine de la Ludwig-Maximilians-Universität et de la Regierung von Oberbayern (approbation des expérimentations animales).

Produits chimiques, anticorps et lignées cellulaires

Sauf indication contraire, les produits chimiques utilisés dans ce travail ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich et tous les anticorps IgG, RPMI, PBS, FBS et pénicilline-streptomycine ont été achetés auprès de Thermo Fisher.

Les lignées cellulaires humaines Jurkat (leucémie à cellules T, DSMZ, n° ACC-282), NALM-6 (leucémie à précurseurs des cellules B, DSMZ, n° ACC-128), MCF-7 (adénocarcinome du sein, DSMZ, n° 115). ACC-13) et Molm-554 (leucémie myéloïde aiguë, DSMZ, n° ACC 300265) ont été obtenus auprès de DMSZ. La lignée cellulaire humaine LNCaP (lésion métastatique de l'adénocarcinome de la prostate, CLS, 6) a été obtenue auprès de CLS. Toutes les lignées cellulaires ont été conservées dans de l'azote liquide. L'authentification réussie de la lignée cellulaire a été réalisée par réaction en chaîne par polymérase pour Jurkat, NALM-7, LNCap et MCF-XNUMX.

Les cellules Jurkat, NALM-6 et Molm-13 ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640, complété par 10 % de FBS, de pénicilline (200 U ml^-1), streptomycine (200 µg ml^-1) et avec ou sans 20 mM supplémentaire l-glutamine pour Jurkat et NALM-6, respectivement. Les cellules MCF-7 ont été cultivées dans un milieu riche en glucose (25 mM d-glucose) Milieu d'Eagle modifié de Dulbecco, complété par 5% de FBS, pénicilline (200 U ml^-1), streptomycine (200 µg ml^-1) et 4 mM l-glutamine et passage à l'aide de Trypsine-EDTA (0.05%). Les cellules SK-BR-3 et LNCaP ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640, additionné de 20 % de FBS et de pénicilline (200 U ml^-1), streptomycine (200 µg ml^-1) et 2 mM l-glutamine et passage à l'aide de TrypLE Select Enzyme.

La lignée cellulaire murine A20 a été stockée dans de l'azote liquide et cultivée dans du RPMI 1640, additionné de 10 % de FBS et de pénicilline (200 U ml^-1), streptomycine (200 µg ml^-1), 200 µM l-glutamine, 25 mM d-glucose, HEPES 10 mM et pyruvate de sodium 1 mM.

Les cellules ont été cultivées dans des flacons de culture cellulaire T-75 à 37 °C et 5 % de CO₂. Les cellules ont été entretenues conformément aux instructions de DSMZ et utilisées pour des analyses cytométriques en flux et cellulaires jusqu'à un maximum de 15 passages. Cette lignée cellulaire a été utilisée comme modèle de lymphome murin à cellules B.

Pour les modèles in vivo, les cellules tumorales NALM-6 ont été transduites par voie lentivirale avec un plasmide pCDH-EF1a-eFly-eGFP comme décrit précédemment^49,50. Un profilage de répétitions en tandem courtes a été utilisé pour vérifier l'origine de cette lignée cellulaire.

Pour les expériences de cytométrie en flux, les anticorps suivants ont été utilisés tels qu'achetés.

Pliage d'objets origami ADN (châssis)

Les mélanges réactionnels contenaient de l'ADN d'échafaudage à une concentration de 50 nM et des brins d'oligonucléotides à 200 nM chacun. Le tampon de réaction comprenait du Tris 5 mM, de l'EDTA 1 mM, du NaCl 5 mM (pH 8) et du MgCl 20 mM.₂. Les mélanges réactionnels ont été soumis à une rampe de recuit thermique à l'aide de dispositifs de cycle thermique Tetrad (MJ Research, maintenant Bio-Rad). Les oligonucléotides ont été obtenus auprès d'IDT. Les échafaudages d'ADN ont été produits en interne selon un autre travail⁵¹. Le tableau ci-dessous présente les rampes pliantes utilisées pour assembler les objets décrits dans le manuscrit.

Électrophorèse sur gel des PTE

Les nanostructures d'ADN pliées ont été soumises à une électrophorèse sur des gels d'agarose de 1.5 % à 3.5 % contenant 0.5 × TBE et MgCl₂ à différentes concentrations pendant environ 2 h à une tension de polarisation de 70 V dans une boîte de gel immergée dans un bain-marie, sauf indication contraire. Les gels d'agarose soumis à une électrophorèse ont été numérisés à l'aide d'un scanner laser Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare) à une résolution de 50 µm par pixel. Les images TIFF 16 bits résultantes ont été analysées à l'aide d'ImageJ v. 1.440. Pour chaque voie contenant l'échantillon, un profil d'intensité transversal a été calculé en faisant la moyenne des valeurs d'échelle de gris dans une boîte de 50 pixels de large. Les intensités maximales des monomères et des bandes d'ordre supérieur ont été déterminées dans la bande cible. Ces valeurs d'intensité ont été utilisées pour une analyse plus approfondie.

Purification, enrichissement et stabilisation in vitro des PTE

Après la réaction de repliement, tous les produits de réaction ont été purifiés par précipitation au PEG.⁵². Pour concentrer les objets d'origami d'ADN (châssis ou PTE), la précipitation ou l'ultrafiltration au PEG a été utilisée. Toutes les procédures ont été réalisées comme décrit précédemment⁵³. Les concentrations d'objets ADN origami ont été analysées avec un instrument Nanodrop 8000 (Thermo Fisher). Avant d'utiliser les objets dans des tests de culture cellulaire, les objets ont été stabilisés pour être utilisés dans des tampons à faible force ionique et en présence de nucléases. Pour cela, nous avons utilisé le protocole d'un autre ouvrage²² et enduit toutes nos structures d'oligolysine K10-PEG, achetée chez Alamanda Polymers.

Conjugaison anticorps-ADN, digestion des anticorps et fixation à des objets origami ADN

Conjugaison d'anticorps IgG de taille réelle : des oligonucléotides modifiés avec une modification 5'- ou 3'-thiol ont été achetés, purifiés par HPLC et séchés (Biomers). Les oligos ont été dissous dans du PBS (NaPi 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7.2) avec du TCEP 5 mM et incubés pendant 1 h à température ambiante. Après purification, 10 nmol de l’oligo thiol réduit ont été mélangés avec 10 équivalents de sulfosuccinimidyl 4-(N-maléimidométhyl) cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC ; dissous dans ddH₂O) (Thermo Fisher) pendant 15 min. Après purification, y compris le changement de tampon en PBS (pH 8), 100 µg d'anticorps dans du PBS (pH 8) ont été ajoutés. Le conjugué a ensuite été purifié par chromatographie échangeuse d'ions (proFIRE, Dynamic Biosensors) en utilisant un gradient de NaCl de 150 à 1,000 7.2 mM dans du PBS (pH  XNUMX). Les conjugués oligo-anticorps purifiés ont été analysés par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium – polyacrylamide et électrophorèse sur gel d'agarose.

Préparation des fragments Fab : les IgG de taille normale ont été digérées et purifiées à l'aide du kit de préparation Pierce Fab (Thermo Fisher, 44985) conformément au manuel du fournisseur. En bref, les IgG ont été incubées avec des billes de papaïne et purifiées à partir de fragments Fc à l'aide de billes d'affinité pour la protéine A. La génération de Fab a été vérifiée par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide.

Conjugaison de fragments Fab : pour éviter une orientation où le paratope du F(ab) pointe vers le châssis de l'origami d'ADN, nous nous sommes appuyés sur une méthode de conjugaison spécifique au site similaire à un autre travail⁵⁴. En bref, l'ADN modifié par le maléimide a été acheté auprès de Biomers ou préparé en mélangeant de l'ADN modifié par une amine avec un agent de réticulation SMCC et par ultracentrifugation ultérieure (filtres 10k, Amicon). Les fragments Fab, qui ont été produits en utilisant la digestion par la papaïne des IgG (Pierce Fab Preparation Kit, Thermo Fisher, 44985) ont été réduits avec 5 mM de TCEP pendant 30 min. L'excès de TCEP a été éliminé par ultracentrifugation (filtres 10k, Amicon) et mélangé avec des brins d'ADN modifiés par du maléimide dans de l'HEPES 50 mM avec du NaCl 200 mM à pH 6.7. Les réactions ont été effectuées pendant une nuit à température ambiante. Cette technique de conjugaison donne des fragments Fab simple et double marqués. Les conjugués F (ab) –ADN monomarqués ont été purifiés par chromatographie par échange d'ions.

Conjugaison de scFv : l'ADN modifié par maléimide a été acheté auprès de Biomers ou préparé en mélangeant de l'ADN modifié par une amine avec un agent de réticulation SMCC. Les scFv contenaient une cystéine N-terminale libre et ont été exprimés et achetés auprès de Genscript ou Icosagen. La réaction a été réalisée comme décrit pour les fragments Fab.

Fixation de conjugués anticorps-ADN à des objets origami ADN : les conjugués anticorps-ADN et les objets origami ADN avec les sites de liaison correspondants ont été incubés dans des rapports équimolaires pendant 1 h à 37 °C.

TEM à coloration négative

Préparation, acquisition et traitement des données

Les produits de réaction purifiés ont été adsorbés sur des grilles Cu400 TEM à décharge luminescente (Science Services) et colorés à l'aide d'une solution aqueuse à 2% de formiate d'uranyle contenant 25 mM d'hydroxyde de sodium. Les échantillons ont été incubés pendant 30 s à 20–25 mM de Mg.²⁺. Des grossissements compris entre 10,000 30,000 et XNUMX XNUMX ont été utilisés pour acquérir les données.

L'imagerie a été réalisée sur différents microscopes.

Les micrographies TEM utilisées dans les figures ont été filtrées passe-haut pour éliminer les gradients de coloration à longue portée et le contraste a été automatiquement nivelé (Adobe Photoshop CS6).

Microscopie à fluorescence

Des expériences de microscopie à fluorescence ont été obtenues sur un microscope confocal Thermo Fisher CX7 avec un incubateur sur scène. Les conditions d'incubation pour les mesures résolues dans le temps étaient identiques aux conditions de culture cellulaire utilisées pour les lignées cellulaires respectives. Les échantillons ont été incubés sur des plaques ibidi à 96 puits (89626).

Dosages cellulaires

Expériences de liaison à la surface cellulaire

Pour les expériences de cytométrie en flux, les cellules ont été cultivées jusqu'à une densité cellulaire de 1.5 à 2.0 × 10.⁶ cellules ml^-1 dans des flacons de culture cellulaire T-75. Les cellules ont été centrifugées pendant 5 min à 160×g et lavé avec du PBS glacé, deux fois. Toutes les expériences de cytométrie en flux ont été réalisées à une densité cellulaire de 2 × 10⁷ cellules ml^-1 en PBS ou médium. L'échantillon (châssis ou PTE) a été ajouté à une concentration finale de 1 nM et incubé pendant les différents moments. Avant l'analyse cytométrique en flux, les cellules ont été centrifugées pendant 5 minutes à 500 ×g et remis en suspension à une concentration cellulaire finale de 2 × 10⁶ cellules ml^-1 en PBS. L'analyse cytométrique en flux a été réalisée sur un Cytoflex (Beckman Coulter) ou Attune Nxt (Thermo Fisher), mesurant l'intensité de fluorescence par excitation à 640 nm et détection par filtre passe-bande à 660/20 nm. Les cellules individuelles ont été contrôlées en fonction de la diffusion vers l'avant par rapport à la diffusion latérale. Pour chaque mesure, les intensités de fluorescence de 50,000 2021 cellules individuelles ont été analysées avec un script interne MATLAB (RXNUMXb).

Test d'activation des lymphocytes T

L'expression de l'interleukine 2, en tant qu'indicateur de l'activation des lymphocytes T, a été analysée à l'aide de tests biologiques d'activation des lymphocytes T (Promega, J1655).³⁵. L’expérience a été réalisée selon les instructions du fournisseur. En bref, des cellules cibles exprimant CD19 (NALM-6) ont été ajoutées à des plaques de microtitrage à 96 puits à une concentration finale de 5 × 10.⁵ cellules ml^-1. Ensuite, une dilution en série de différents échantillons (en milieu RPMI 1640) a été ajoutée. Finalement, les cellules effectrices TCR/CD3 génétiquement modifiées ont été ajoutées à une concentration finale de 1.3 × 10.⁶ cellules ml^-1. Le mélange réactionnel a été incubé pendant 6 h à 37 °C et 5 % de CO₂. Les cellules effectrices génétiquement modifiées (Jurkat-NFAT) expriment intercellulairement une luciférase si le promoteur de l'interleukine 2 est activé. Grâce à l'ajout du réactif Bio-Glo, qui comprend un substrat pour la luciférase, le signal de luminescence est un signal proportionnel direct pour l'activation des cellules effectrices TCR/CD3, qui a été analysé dans un lecteur de plaque de microtitration (Clariostar Plus, BMG ). Les données ont été normalisées et le signal de fond a été corrigé.

Test d'internalisation

Le test d'internalisation a été réalisé selon un autre travail⁵⁵. Chaque brique d'origami d'ADN (châssis) portait une sonde d'internalisation de fluorescence (FIP) comprenant une séquence saillante avec un colorant Cy5 attaché à son terminal (Fig. 4, encadré à droite). Ce FIP peut être désactivé à l'aide d'un brin de trempe avec une séquence complémentaire au FIP et d'un Black Hole Quencher-2 attaché. Lors de l'hybridation, Black Hole Quencher-2 éteint la fluorescence du FIP. Étant donné que le brin extincteur ne peut atteindre le châssis que sur la surface de la cellule, et non le châssis internalisé, la quantité de signal désactivé est proportionnelle à la quantité de châssis exposé à la surface.

Cellules NALM-6 (1 × 10⁷ cellules ml^-1) ont été incubés avec un châssis 1 nM pendant 1 h à 37 °C dans le milieu de culture cellulaire, puis lavés pour éliminer l'excès de châssis. Après lavage, les cellules ont été remises en suspension dans le milieu de culture cellulaire et incubées à 37 °C. A chaque instant, une mesure consiste à prélever un échantillon et à l'incuber pendant 10 min à 4 °C sur de la glace. La moitié de l'échantillon est incubée sans brin extincteur et l'autre moitié est incubée avec un brin extincteur de 100 nM. Les deux échantillons ont été incubés pendant 10 minutes sur de la glace pour permettre l'hybridation du quencher (si ajouté) et pour arrêter l'internalisation. La fraction du châssis internalisé avec deux anticorps anti-CD19 a été calculée à partir de la fluorescence médiane F comme suit.

Test de destruction des lymphocytes T cytotoxiques des cellules tumorales liquides

Préparation des cellules cibles

Les cellules cibles (par exemple, NALM-6) ont été colorées par fluorescence à l'aide du kit de prolifération cellulaire CellTrace CSFE (Thermo Fisher, C34554) selon le protocole du fabricant.

Préparation des PBMC (effecteur)

Pour le test de destruction des lymphocytes T cytotoxiques, nous avons utilisé des PBMC humaines congelées (STEMCELL, 70025.1 ou CTL, CTL-UP1). Nous avons manipulé les cellules PBMC conformément aux instructions du fournisseur.

Essai

Ici 2 × 10⁵ Les cellules cibles colorées au CSFE par millilitre ont été incubées avec 1 × 10⁶ PBMC ml^-1 dans le milieu de culture cellulaire à 37 °C (5% CO₂) et les PTE dans des concentrations différentes ou sans recruteur supplémentaire. La fluorescence cellulaire et l'intensité de diffusion ont été déterminées à l'aide d'une cytométrie en flux Attune Nxt avec un échantillonneur automatique Cytkick Max (Thermo Fisher). Les contaminations résiduelles, telles que les sels ou les endotoxines, peuvent provoquer la lyse non spécifique des cellules cibles. Ces effets sont particulièrement prononcés à des concentrations élevées de PTE et dépendent du type de cellule.

Test cytotoxique de destruction des cellules T des cellules tumorales solides

Préparation des cellules cibles : les cellules cibles (par exemple, MCF-7) ont été ensemencées 24 heures à l'avance à partir d'une monocouche confluente.

Préparation des PBMC (effecteur) : pour le test de destruction des lymphocytes T cytotoxiques, nous avons utilisé des PBMC humaines congelées (STEMCELL, 70025.1 ou CTL, CTL-UP1). Nous avons manipulé les cellules PBMC conformément aux instructions du fournisseur.

Test : les cellules cibles confluentes ont été incubées avec des PBMC (E:T 2:1 ou 4:1) dans un milieu de culture cellulaire à 37 °C (5 % de CO₂) et les PTE dans des concentrations différentes ou sans recruteur supplémentaire. La fraction de cellules cibles vivantes a été déterminée en quantifiant la quantité d'ATP après 48 heures via le système de titrage cellulaire Bio-Glo (Promega) d'échantillons avec et sans PTE. Les contaminations résiduelles, telles que les sels ou les endotoxines, peuvent provoquer la lyse non spécifique des cellules cibles. Ces effets sont particulièrement prononcés à des concentrations élevées de PTE et dépendent du type de cellule.

Modèles animaux in vivo

Détermination des endotoxines de constructions prêtes in vivo

La concentration d'endotoxine a été mesurée avec un instrument Charles River nexgen-PTS150 V10.2.3. Nous avons utilisé des cartouches avec une plage comprise entre 5.00 et 0.05 EU ml^-1. Les échantillons ont été dilués 25 fois pour correspondre à la plage sensible des cartouches. Le niveau seuil d'endotoxine pour les études sur la souris a été fixé à 36 EU ml^-1. Cette valeur est conforme aux spécifications données par la FDA⁴².

Expériences in vivo sur des souris

L'approbation de toutes les expériences sur les animaux a été accordée par les autorités de régulation locales (Regierung von Oberbayern).

NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1WjI/SzJ (NSG) ont été achetés chez Janvier ou élevés en interne. Les souris NSG sont porteuses d'une mutation du gène de réparation de l'ADN Pkrdc, associée à un déficit immunitaire combiné sévère, conduisant à un déficit en lymphocytes T et B. L'allèle nul complet de la chaîne gamma du récepteur de l'IL-2 (ll2rg) abroge la signalisation des cytokines homéostatiques critiques telles que l'IL-2, l'IL-4, l'IL-7, l'IL-9 et l'IL-15, empêchant ainsi le développement de cellules fonctionnelles. Cellules NK. Enfin, le fond NOD compromet davantage la branche innée du système immunitaire (fonctionnalité réduite des cellules dendritiques et des macrophages). En général, ces souris hautement immunodéficientes permettent une greffe stable et reproductible de tumeurs humaines et de cellules T chez la souris et sont actuellement considérées comme le modèle de pointe pour les modèles de xénogreffe humaine chez la souris.^56,57,58.

Tous les animaux ont été hébergés dans des installations spécifiques exemptes d’agents pathogènes.

L'imagerie BLI et fluorescence a été réalisée à l'aide de la plateforme d'imagerie in vivo Lumina X5 (IVIS, PerkinElmer), comme décrit précédemment⁵⁹. En bref, les souris ont été anesthésiées avec un mélange isoflurane-oxygène de 1.5 à 2.5 % pour toutes les procédures d’imagerie en direct. Pour BLI, le substrat (Xenolight d-sel de potassium de luciférine, PerkinElmer) a été injecté par voie intrapéritonéale conformément aux instructions du fabricant. Pour l’analyse des organes, la fluorescence de fond de chaque organe a été soustraite.

NALM-6-luc⁺-GFP⁺ des modèles de xénogreffe ont été établis par i.v. injection dans la veine de la queue.

Aucun point de données (souris) n’a été exclu dans les études animales.

Cytométrie en flux pour les expériences in vivo

Les données cytométriques en flux ont été générées à l'aide d'un BD LSRFortessa II, d'un Beckman Coulter CytoFLEX LX ou d'un Thermo Fisher Attune Nxt avec un chargeur automatique. L'analyse cytométrique en flux des organes a été réalisée comme indiqué précédemment⁶⁰. Les suspensions unicellulaires d'organes prélevés ont été colorées avec l'anti-CD3 BV711 humain (clone, OKT3), l'anti-CD4 PerCP-Cy5.5 (clone, OKT4), l'anti-CD8 PE (clone, HIT8a), l'anti-CD19 BV786 ( clone, HIB19) et des anticorps anti-CD69 PE-Cy7 (clone, FN50) ou de souris anti-CD45 bleu pacifique (clone, 30-F11) (Biolegend). Un colorant de viabilité fixable (eFluor 780, eBioscience) a été utilisé pour exclure les cellules mortes. La charge tumorale maximale autorisée par les autorités réglementaires locales n'a pas été dépassée.

Logiciels et analyses statistiques

Les données cytométriques en flux ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo v. 10.3 à v. 10.8.1. La quantification des intensités de bioluminescence et de fluorescence a été réalisée à l'aide de Living Image 4.4 (PerkinElmer). L'analyse statistique a été réalisée avec GraphPad Prism v. 9.4.0. Les calculs de puissance (pour les expériences in vivo) ont été effectués à l'aide de G*Power 3.1 avec un alpha, une puissance et une taille d'effet donnés.

Statistiques et reproductibilité

Les statistiques et la reproductibilité sont indiquées dans la légende des figures, par exemple les répliques biologiques ou techniques. Les images de gel d'agarose présentées dans les figures sont des exemples représentatifs d'expériences qui ont donné des résultats identiques ou similaires. Pour l'analyse TEM : le nombre total d'analyses TEM effectuées de manière similaire sur des échantillons préparés selon les mêmes protocoles variait d'une expérience à l'autre ; en cas de répétitions, la reproductibilité a été observée.

Résumé du rapport

De plus amples informations sur le design de la recherche sont disponibles dans Sommaire des rapports sur le portefeuille de la nature lié à cet article.

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• La source: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01471-7