用于体内高分辨率神经记录和刺激的纳米多孔石墨烯薄膜微电极 - 自然纳米技术

由柏拉图重新发布

关注： 0

材料制备和表征

将GO水溶液用去离子水稀释以获得0.15mgml^{- 1} 将溶液通过孔径为0.025μm的硝酸纤维素膜进行真空过滤，形成GO薄膜。然后使用去离子水中的湿转移将薄膜转移到目标基板上，并在100℃下进一步热退火2分钟。 GO 薄膜-基底叠层在标准高压釜中于 134℃ 下水热还原 3 小时，形成 EGNITE。 EGNITE 所有特性研究的基础基材是正方形 (1 × 1 cm²）的硅/二氧化硅₂ （400 μm/1 μm）。

XPS

XPS 测量使用 Phoibos 150 分析仪 (SPECS) 在超高真空条件下进行（基础压力，5 × 10^-¹⁰ mbar) 和单色 Al Kα X 射线源 (1,486.74 eV)。通过能量为 50eV、步长为 1eV 获得概览光谱，通过能量为 20eV、步长为 0.05eV 获得高分辨率光谱。最后条件下的总体分辨率为 0.58 eV，通过测量 Ag 3 的半峰全宽来确定d溅射银的 5/2 峰。 XPS 分析显示，水热处理后，C-O 峰（与环氧基团相关）大幅下降，但由于羟基、羰基和羧基，C-OH、C=O 和 C(O)OH 的贡献很小。减少后仍保留。 O1 的反卷积s Peak 证实了这种行为。对C1的主要贡献s 然而，水热还原后的信号来自 sp² 杂化C-C轨道^34,57.

X射线衍射

X 射线衍射测量（θ - 2θ 扫描）在材料研究衍射仪（Malvern PANalytical）中进行。该衍射仪具有水平 ω - 2θ 测角仪（半径 320mm）采用四圆几何形状，并与带有 Cu Kα 阳极的陶瓷 X 射线管一起使用（λ = 1.540598 Å)。使用的探测器是 Pixcel，它是基于 Medipix2 技术的快速 X 射线探测器。

拉曼光谱

拉曼光谱测量使用配备有 488 nm 激光激发线的 Witec 光谱仪进行。对于测量，拉曼光谱是使用 50 倍物镜和每纳米 600 个凹槽的光栅获得的；激光功率保持在 1.5mW 以下以避免样品加热。

TEM

使用 Helios NanoLab DualBeam (LMA-INA) 制备聚焦离子束薄片，用于 EGNITE 样品的横截面研究。使用在 20kV 下运行的 Tecnai F200 显微镜，通过 TEM 进行结构分析，包括 HRTEM 和高角度环形暗场 STEM 技术。 STEM-EELS实验在Tecnai F20显微镜上进行，工作电压为200 KeV，孔径为5mm，相机长度为30mm，会聚角为12.7 mrad，收集角为87.6 mrad。由于我们在磁芯损耗采集中使用每像素 0.5 eV 和 250 eV 作为起始能量，因此我们没有获得预期的 1,839 eV 处的 Si K 边缘、2,122eV 处的 Pt M 边缘和 2,206eV 处的 Au M 边缘。 100 eV。通过将我们的注意力集中在还原的 GO 层上并假设分析的边缘（在我们的例子中为 C 和 O）总和为 XNUMX%，获得了相对 C-O 原子组成。这个假设在我们的案例中是有效的，如补充信息地图。使用 Hartree-Slater 模型计算能量微分截面，使用低功率模型计算背景。

电导率

使用 Keithley 2400 源表以两点配置进行电导率测量。测量的样品由 1 × 1 cm 的 EGNITE 薄膜组成² 在 SiO2 顶部₂ 基材。

数据分析

使用 Python 3.7 软件包（Numpy、Pandas、Scipy、Xrdtools、Lmfit、Rampy、Peakutils、Matplotlib）分析 X 射线衍射、拉曼和 XPS 数据。平面之间的距离是根据斯涅尔定律从 X 射线衍射测量中计算出来的。将数据移入空间域后，即可拟合峰值的最大值。相应的距离给出了平面之间距离的平均值。与这些平均值的偏差是根据空间域上峰的洛伦兹拟合的半高全宽计算的。通过在相应特征的预期位置上拟合峰值卷积来分析 XPS 和拉曼光谱测量。 GO 和 EGNITE 的电导率值通过拟合得到 I–V 电导率测量中测量的欧姆定律曲线。数据是 n 每次测量 = 1。

灵活的阵列制造

器件的制造如补充图所示。 4。器件在 4 英寸 Si/SiO 上制造₂ (400 μm/1 μm) 晶圆。首先，将 10 µm 厚的 PI 层（PI-2611，HD MicroSystems）旋涂在晶圆上，并在富含氮气的气氛中在 350°C 下烘烤 30 分钟。使用图像反转光致抗蚀剂（AZ5214，Microchemicals）的光学光刻技术对金属迹线进行图案化。使用电子束蒸发沉积20nm的钛和200nm的金并进行剥离。我们使用厚度约为 1μm 的 EGNITE 薄膜作为电化学性能和阵列灵活性之间的权衡。转移 GO 薄膜后，用电子束蒸发铝，并使用负性光刻胶（nLOF 2070，Microchemicals）定义未来微电极顶部的区域并剥离。接下来，使用氧反应离子蚀刻（RIE）以 5W 蚀刻 500 分钟，除未来的微电极外，对 GO 薄膜进行蚀刻，并用磷酸和硝酸的稀释溶液蚀刻保护铝柱。然后，将 3 µm 厚的 PI-2611 层沉积到晶圆上，并如前所述进行烘烤。然后使用正性厚光刻胶（AZ2611，Microchemicals）定义微电极上的 PI-9260 开口，该光刻胶充当后续氧气 RIE 的掩模。随后，再次使用 AZ9260 光刻胶和 RIE 在 PI 层上对器件进行图案化。然后在丙酮中去除光致抗蚀剂层，并在异丙醇中清洁晶片并干燥。最后，将器件从晶片上剥离下来，准备放入灭菌袋中，在标准高压釜中于 134℃ 下水热处理 3 小时。

微电极电化学表征

使用万通 Autolab PGSTAT128N 恒电位仪在含有 1 mM 磷酸盐缓冲液、4417 mM NaCl 和 10 mM KCl（pH 137）的 2.7× PBS（Sigma-Aldrich，P7.4）中使用三电极配置对微电极进行电化学表征。 Ag/AgCl 电极（FlexRef，WPI）用作参比电极，铂丝（Alfa Aesar，45093）用作反电极。

在性能评估之前，对电极施加 10,000 个电荷平衡脉冲（1ms，15μA）。将电极暴露于连续脉冲方案中，在 100 mV s 下进行 0.9 个循环伏安法循环（−0.8 至 +50 V）^{- 1}，重复 20 次 5,000 个脉冲 (1ms) 并重新测定开路电位。

数据分析

使用 Python 3.7 软件包（Numpy、Pandas、Scipy、Pyeis、Lmfit、Matplotlib）分析电化学表征数据。将阻抗谱数据拟合到由电阻（R）与恒相位元件（CPE）串联。由此，CPE 值近似为电容，并除以微电极几何面积，以获得 EGNITE 界面电容的等效值。微电极电荷存储电容（CSC）是通过循环伏安法测量计算的，通过积分测量电流的阴极和阳极状态并通过扫描速率归一化。 EGNITE在100 mV扫描速率下的阴极和阳极电荷存储电容（cCSC和aCSC）分别为45.9 ± 2.4和34.6 ± 2.8 mC cm^{- 2}，分别（n = 3）。正如其他材料所报道的⁵⁸，获得的 CSC 取决于扫描速率（补充图 2）。 5）。为了评估氧还原反应的存在，我们测量了氮气吹扫电解质下的 CV 波形⁵⁹ 并且没有观察到波形的实质性差异（补充图1）。 6）。然而，我们的结果并没有完全解决氧还原反应对 EGNITE 电荷注入能力的影响，需要做额外的工作来正确研究这一点。通过确定电流脉冲幅度来确定微电极电荷注入能力（CIC），该电流脉冲幅度引起与电极电化学水窗口匹配的电压差（去除欧姆降后）（与 Ag/AgCl 相比，阴极为 -0.9 V，阳极为 +0.8 V））（补充图。 17)⁶⁰.

统计分析

数据为平均值±s.d.， n = 18 对于 EIS 和 n 对于计时电位计，= 3。阴极电容电压偏移图的数据是每个脉冲形状的一个事件的阴极电容电压偏移的平均值 n = 3个电极。

机械稳定性评价

超声波处理

EGNITE 电极阵列放置在超声水浴 (Elmasonic P 180H) 中装满水的烧杯内。在 37kHz、15W 下进行超声处理 200 分钟，然后在 15kHz 下再进行 37 分钟超声处理，功率升至 300W。在超声处理步骤之前和之后获取电极图像。

弯曲试验

弯曲设置（图 1） 2k)由三根圆柱杆组成；中间的一个（直径，700 μm）被降低，产生131°的弯曲角度。三个柔性微电极阵列用于弯曲测试。每个阵列包含 18 个直径为 50μm 的微电极。两个阵列在 10 和 20 个循环后进行测量，而一个器件仅测量 10 个循环，因为它在测量后的处理过程中被损坏。弯曲测试周期包括 10 秒长的负载施加加上 10 秒无负载。在 10 次和 20 次弯曲循环之前和之后对器件进行电化学表征（EIS 和 CV）。

皮层神经记录

皮质上植入

所有实验程序均按照欧洲共同体理事会的建议和法国实验动物护理和使用立法进行。该方案得到了格勒诺布尔伦理委员会 (ComEth) 的批准，并得到了法国外交部的授权（编号 04815.02）。 Sprague-Dawley大鼠（雄性，4个月大，称重〜600μg）用氯胺酮（50μmg/kg（体重））和赛拉嗪（10μmg/kg（体重））肌肉注射麻醉，然后固定在立体定位支架上。去除颞颅骨暴露听觉皮层。保留硬脑膜以避免损伤皮质组织。在顶点处钻一个孔以插入参比电极，并在距离第一个孔向前7mm处钻第二个孔以插入接地电极。电极是用于集成电路插座的 0.5 毫米厚的引脚。它们被放置与硬脑膜进行电接触，并用牙科水泥固定在头骨上。然后我们将表面微电极带安装在听觉皮层上，如图 XNUMX 所示。 3b。静脉图案识别了克里格大鼠脑图第 41 区的听觉皮层。皮质信号同时以 1,000 的增益放大，并以 33kHz 的采样率数字化。扬声器位于大鼠耳朵前面 20 厘米处，暴露的皮质对侧，发出声音刺激。所传递的刺激由放置在耳朵附近的 0.25 英寸麦克风（Brüel & Kjaer，4939）进行监测，并以声压级（dB SPL re 20μPa）呈现。我们检查了 80dB SPL 的交替喀哒声和 70dB SPL 的音调突发刺激所引起的顶点正（负上）中延迟响应，频率范围为 5 至 40kHz，上升和下降时间为 5ms，持续时间为 200 毫秒。

数据分析

使用 Python 3.7 软件包（Numpy、Pandas、Scipy、Neo、Elephant、Sklearn Matplotlib）和自定义库 PhyREC（https://github.com/aguimera/PhyREC）。均方根值是在频率高于 20Hz 时使用 200ms 的滑动窗口计算的。频谱图的计算范围为 70 Hz 至 1.1 kHz。 PSD 经过 60 秒的连续记录计算。对于给定的电极阵列，计算了两个 PSD：体内 (IV) 和死后 (PM)。 SNR 以 dB (20 × ln(r.m.s.(IV)/r.m.s.(PM))) 表示，并在 20 Hz 和 10 kHz 之间以对数间隔内插 1 个点。

统计分析

表皮层神经数据如图 1 所示。 3 取自对单个动物的单独测量。在图中。 3c，显示了 64 个电极的数据。在图中。 3d，显示了来自两个选定电极的数据。在图中。 3f，PSD 和 SNR 由 64 个 EGNITE 电极计算得出，并显示为平均值±s.d。在补充图中。 12c、d 提供了 192 个 EGNITE 电极的中值数据 n = 3 个实验和 60 个铂电极 n = 1个实验。

皮质内神经记录

皮质内植入

用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（75:1，0.35ml/28g腹腔注射）麻醉动物，并用提供1.5%异氟烷的吸入面罩维持该状态。将几颗微型螺钉放入头骨中以稳定植入物，小脑顶部的一颗用作一般接地。探针被植入前额叶皮层（坐标：AP，1.5mm；ML，±0.5mm；DV，距前囟-1.7mm）。通过用麦芽糖涂覆探针（参见下面的方案）来进行植入，以提供临时探针硬度并促进探针插入。探针用牙科粘固粉密封。 TDT-ZifClip 连接器用于通过微型电缆将探头连接到电生理系统。手术后，小鼠经历了1周的恢复期，接受镇痛（丁丙诺啡）和抗炎（美洛昔康）治疗。使用 Intan RHD30 放大器以 2132kHz 采样率使用多通道 Open Ephys 系统记录神经活动。听觉任务实验是在一个隔音箱中进行的，里面有两个扬声器，使用基于先前描述的工作的协议⁶¹。声音刺激由 15 毫秒长的白噪声喀哒声组成，重复 100 次（循环），每次间隔 5 秒（刺激间间隔）。在任务期间，动物能够自由活动。

麦芽糖硬化剂方案

将麦芽糖水溶液加热至玻璃化转变点（T_g），在 130 至 160°C 之间，使用热板或微波炉。一旦麦芽糖变粘，探针的背面仅与麦芽糖接触。当麦芽糖冷却时，它会使探针变硬并变硬。

数据分析

来自每个电极的神经信号被离线过滤以提取 SUA 和 LFP。 SUA 是通过过滤 450 到 6,000 Hz 之间的信号来估计的，并且使用 Offline Sorter v.4 (Plexon) 进行主成分分析来对单个神经元的尖峰进行排序。为了获得 LFP，使用 Python 中自定义编写的脚本将信号下采样至 1kHz、去趋势和陷波滤波，以消除噪声线伪影（50Hz 及其谐波）。 AEP SNR 计算为峰值 N1 幅度与 s.d 的比率。刺激前 20 毫秒的时间段。

统计分析

数据如图所示 3小时，我是平均值 ± s.d.， n = 30作为平均试验次数。显示了第 30 天、第 60 天和第 90 天从同一电极记录的数据。显示了来自单个动物的数据。

慢性外皮层生物相容性

装置的手术植入

本研究共使用了 27 只成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠（查尔斯河）。动物饲养在环境温度为 21±2°C、湿度为 40-50%、12 小时光照/12 小时黑暗周期的环境中。大鼠被分组饲养，并在整个实验期间自由进食和饮水。实验程序按照《动物福利法》（1998）进行，并得到英国内政部和当地动物福利伦理审查机构（AWERB）的批准。在手术期间用异氟烷（2-3%）麻醉动物，并通过脚趾捏反射测试监测麻醉深度。将动物放置在位于热毯上方的立体定位框架（Kopf，900LS）中以维持体温。开颅孔（〜使用带有5mm毛刺钻头的牙钻在距中线4mm处制作1mm×0.9mm），去除硬脑膜并将皮质装置放置在大脑皮质表面上。用 Kwik-sil 密封开颅孔，然后用牙科水泥固定，并将皮肤缝合。皮下注射生理盐水（1ml/kg（体重））和丁丙诺啡（0.03mg/kg（体重））以补充丢失的液体并减轻术后疼痛，并撤回麻醉。

组织收集和处理

在植入后 2、6 或 12 周，通过适合要进行的分析类型的方法终止动物。

组织学和免疫组织化学

植入后 2、6 或 12 周，通过心脏灌注肝素（10Uml^{- 1}, Sigma-Aldrich) PBS，然后加入 4% 多聚甲醛（PFA，Sigma-Aldrich）的 PBS 溶液。将脑在 4% PFA 中后固定 24 小时，然后转移至含 30% 蔗糖的 PBS 中至少 48 小时，然后在异戊烷中冷冻。然后将大脑储存在-80°C下，直到在25μm处进行冷冻切片。然后对组织进行离子钙结合接头分子 1 (Iba-1) 染色，以确定小胶质细胞的激活水平。简而言之，将组织切片用含有 5% Triton-X 的 PBS 中的 0.1% 山羊血清封闭 1小时，然后与抗 Iba-4 一抗（1:1, 1,000-019；Wako）在 19741°C 下过夜孵育。然后用二抗、抗兔 Alexa Fluor 594（1:400，A-11012；Thermo Fisher）在室温下将切片染色 1 小时。使用含有 4,6-二脒基-2-苯基吲哚 (Thermo Fisher) 的 Prolong Gold 抗褪色封片剂对载玻片进行封片。探头覆盖面积为3 × 3.7 mm² 在大脑皮质表面；选择用于染色的组织切片覆盖该区域长度为 3.2mm 的区域。使用 3DHistech Pannoramic-250 显微镜载玻片扫描仪以 20 倍对载玻片进行成像，并使用 CaseViewer v.2.4 (3DHistech) 分析图像。为了评估小胶质细胞的激活，覆盖了 3.2 毫米的区域，每 100 微米分析一张图像。图像以 8.5 倍放大倍率拍摄，详细显示了皮质探针部位的一部分，距离大脑中线 3 毫米，包围了探针部位正下方的区域。

图像处理

使用小胶质细胞表型表征算法对显微镜数据进行图像处理（补充图1）。 13）。使用定制的 CellProfiler*（Broad Institute，v.3.1.9，来自 https://cellprofiler.org/）管道。首先，EnhanceOrSuppressFeatures 模块用于通过应用管状增强方法来增强神经突等丝状结构。使用IdentifyPrimaryObjects 模块从增强的图像中分割细胞。对细胞的初步测量表明，合适的物体直径范围是 3-40 像素。在此直径范围之外或接触图像边缘的物体被丢弃。使用两类 Otsu 自适应阈值策略对细胞进行分割，自适应窗口大小为 50 像素。由IdentifyPrimaryObjects模块识别的对象被输入到MeasureObjectSizeShape模块以计算细胞分类所需的属性。在ClassifyObjects模块中，指定分类基础的类别为AreaShape，并选择Extent作为相应的度量。细胞被分类为 “激活或非激活基于其范围属性，即单元占据的面积与其边界框占据的面积的比率。这种分类方法的合理性在于，激活的小胶质细胞具有较大的细胞体并且没有突起，因此与未激活的小胶质细胞相比，它们占据的边界框比例要大得多。最后，使用CalculateMath 和ExportToSpreadsheet 模块计算并输出所需的统计数据。

统计分析

数据集是 n = 3 对于每种设备类型（仅 PI 植入物 (PI)；具有暴露的微加工金 (gold) 的 PI；以及在所有时间点具有微加工金和 EGNITE (EGNITE) 的 PI），但 6 周金除外，其为 n 对于 ELISA 数据，= 2。在每个时间点合并对侧半球以给出 n 植入后 9 周和 2 周 = 12 n 植入后 8 周 = 6。使用 GraphPad Prism v.8 软件进行数据分析。使用双向方差分析 (ANOVA) 和 Tukey 多重比较检验（在适当情况下）完成统计分析； P < 0.05被认为是显着的。

ELISA

植入期后，通过颈脱位处死动物。从大脑的右半球和左半球提取脑组织，在液氮中速冻并储存在-80°C直至进一步使用。使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail，Thermo Fisher）的 NP-40 裂解缓冲液（150 mM NaCl、50 mM Tris-Cl、1% Nonidet P40 替代品，Fluka，pH 调整至 7.4）裂解组织，随后对组织进行机械破坏（TissueLyser LT，Qiagen）。然后将样品以 10 转/分的速度离心 5,000 分钟，并将上清液储存在 4°C 下直至进一步使用。 LEGENDplex 大鼠炎症面板（目录号 740401，BioLegend）是一种基于微珠的多重 ELISA 试剂盒，用于量化以下细胞因子； IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-18、IL-33、CXCL1 (KC)、CCL2 (MCP-1)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、干扰素-γ和肿瘤坏死因子。该试剂盒按照制造商的说明运行，蛋白质加载量固定为 15 µl。与上清液一起孵育后，将珠子在 BD FACSVerse 流式细胞仪上运行，并使用 LEGENDplex 数据分析软件分析数据。

神经刺激

束内植入

所有动物实验均由巴塞罗那自治大学伦理委员会根据欧洲共同体理事会指令 2010/63/EU 批准。将动物饲养在22±2℃、12小时光照/12小时黑暗循环下，并自由提供食物和水。麻醉雌性 Sprague–Dawley 大鼠的坐骨神经（250–300 g，〜18 周龄）通过手术暴露，并借助连接到 10-0 环线的直针将 TIME 电极横向植入坐骨神经⁴⁶。在解剖显微镜下监测该过程，以确保神经束内活性部位的正确位置（图1）。 4b）。实验过程中，用加热垫维持动物体温。

通过应用每相固定持续时间 100μs 的双相电流脉冲序列，并通过不同的 EGNITE 以 0 或 150μA 步长以 1 或 3μA 的幅度将振幅增加 3 秒（刺激器 DS33、数字定时器）来进行神经刺激。微电极。同时，使用放置在每块肌肉中的小针电极（长 4mm，直径 13mm，不锈钢针电极 A-0.4-03BEP，仿生）记录 GM、TA 和 PL 肌肉的 CMAP⁶²。有源电极放置在肌腹上，参考电极放置在肌腱水平上。肌电图记录经过放大（GM 和 TA × 100，PL × 1,000；P511AC 放大器，Grass）、带通滤波（3Hz 至 3kHz）并使用 PowerLab 记录系统（PowerLab16SP、ADInstruments）以 20kHz 进行数字化。

数据分析

测量从基线到最大负峰值的每个 CMAP 的幅度。将电压峰值测量值标准化为实验中每块肌肉获得的最大 CMAP 幅度。计算每个活动部位的选择性指数 (SI)，作为一块肌肉的归一化 CMAP 振幅与 CMAP 之间的比率_i，以及三块肌肉中标准化 CMAP 振幅的总和，遵循公式 SI_i = n世界注册会计师协会_i/Σn世界注册会计师协会_j，在引起最小功能相关肌肉反应的最小刺激电流幅度（定义为其中一块肌肉的 CMAP 幅度相对于先前确定的该肌肉的最大 CMAP 幅度至少 5%）。然后，选择三块肌肉中每块肌肉具有最高 SI 的活动位点作为给定实验中每块肌肉的 SI。

慢性神经内生物相容性

遵循先前报道的程序^50,63，麻醉的 Sprague-Dawley 雌性大鼠的坐骨神经（250-300 g，〜18周龄）被暴露，并且将带有或不带有EGNITE的体内生物相容性装置纵向植入坐骨神经的胫骨支（n = 每组 6–8 人）。简而言之，用连接到 10-0 环线（STC-6，Ethicon）的直针在三叉处刺穿神经；线拉动弯曲电极条的箭头形尖端。尖端被切割以去除线，并且每个臂的尖端稍微弯曲以避免装置退出。选择纵向植入物是因为它可以更好地研究神经内的异物反应⁵⁰.

神经和动物功能评估

在植入后随访期间通过神经传导、痛觉测量和步行轨迹运动测试对动物进行评估⁶²。对于传导测试，通过坐骨切迹处的针电极刺激植入的爪子和对侧爪子的坐骨神经，并如上所述记录 PL 肌肉的 CMAP。测量了 CMAP 的潜伏期和幅度。对于海觉测量测试，将大鼠放置在金属丝网平台上，并使用连接到电子冯弗雷海觉计（Bioseb）的金属尖端施加机械无害刺激。测量植入爪子与对侧爪子的伤害感受阈值（动物收回爪子时的力，以克为单位）。对于步行道测试，后爪的足底表面涂有黑色墨水，让每只老鼠沿着走廊行走。采集足印，计算坐骨功能指数⁶².

组织学

2或8周后，对动物进行PFA（4%）灌注，并收获坐骨神经、后固定、冷冻保存并进行组织学分析。为了评估 FBR，用低温恒温器 (Leica CM15) 将坐骨神经切成 190 μm 厚的横截面。样品用有髓轴突（抗 RT97，用于标记 Neurofilament 200K，1:200；发育研究杂交瘤库）和巨噬细胞（抗 Iba-1，1:500；Wako）的一抗进行染色。然后，将切片与二抗驴抗小鼠Alexa Fluor 1和驴抗兔Alexa Fluor 488（555:1，Invitrogen）在室温下孵育200小时。选择胫神经植入物中央部分的代表性切片，使用连接数码相机（DS-Ri2，Nikon）的落射荧光显微镜（Eclipse Ni，Nikon）拍摄图像，并使用 ImageJ 软件（National Institutes）进行图像分析健康）。对胫神经整个区域中 Iba-1 阳性细胞的数量进行定量，并测量组织囊的厚度作为植入物每侧到最近轴突的平均距离。