Наноплазмонная амплификация в микрофлюидике позволяет ускорить колориметрический количественный анализ биомаркеров нуклеиновых кислот патогенов – Nature Nanotechnology

Дизайн исследования

Это исследование было одобрено Управлением по этике исследований Макгилла (Институциональный наблюдательный совет, A03-M24-21B). Планировалось разработать универсальную платформу для молекулярного выявления инфекций дыхательных путей в местах оказания медицинской помощи. Мы использовали вирусные частицы гриппа А H1N1, РНК SARS-CoV-2 и термоинактивированные вирусные частицы SARS-CoV-2 для быстрой диагностики на основе плазмонно-усиленных анализов RT-LAMP. РНК MERS-CoV и РНК HCoV-229E использовались в качестве отрицательного контроля для анализов RT-LAMP. Кроме того, для специфического обнаружения вызывающих беспокойство вариантов SARS-CoV-2 использовался анализ RCA. Наконец, мы использовали 33 деидентифицированных SARS-CoV-2-положительных человеческих образца (подтвержденных RT-PCR), полученных из биобанка PRESERVE Pandemic Response Biobank Университетской сети здравоохранения, и 15 SARS-CoV-отрицательных образцов (подтвержденных qPCR) в качестве контроля в образце пациента. изучать. В качестве доказательства принципа профилирование ДНК E. палочки и MRSA определяли с использованием анализов LAMP. Синегнойной палочки использовали в качестве отрицательного контроля для анализов LAMP. Это исследование проводилось в Монреале, Канада, с апреля 2020 года по декабрь 2022 года.

Материалы

Материалы были получены следующие: полистироловые наношарики (частицы полистирола (PS-R); Micro Particle); синтетическая РНК SARS-CoV-2 (Американская коллекция типовых культур (ATCC); Cedarlane); SARS-CoV-2 B.1.1.7 Альфа-вариант РНК (ATCC VR-3326D; Cedarlane); MERS-CoV (ATCC VR-3248SD; Cedarlane); инактивированный нагреванием SARS-CoV-2 (ATCC VR-1986HK; Cedarlane); инактивированный нагреванием вирус гриппа А H1N1, штамм NY/01/09 (0810248CFHI; Cedarlane); и E. палочки (№ 211540, Merlan Scientific). Колориметрическая мастер-микс RT-LAMP и фермент HiFi Taq DNA Ligasa (New England Biolabs); PLP, праймеры RCA и синтетические кДНК-мишени SARS-CoV-2, MgCl₂, KCl, никотинамидадениндинуклеотид (NAD) и Triton X-100 (Sigma Aldrich); и использовали праймеры LAMP и дитиотреитол (DTT) (Thermo Fisher Scientific). Объединенная слюна здорового человека (IRHUSL50ML) и слюна здорового человека от одного донора (IRHUSLS5ML) были приобретены у Innovative Research и хранились по прибытии при температуре –80 °C. Образцы РНК варианта SARS-CoV-2 (Омикрон, Дельта, Эта и Гамма) были получены из сотрудничающей лаборатории Университета Макгилла (Лаборатория Видала). РНК HCoV-229E была получена из сотрудничающей лаборатории Института медицинских исследований Леди Дэвис в Еврейской больнице общего профиля (лаборатория К. Лян). ДНК MRSA и П. палочка ДНК были получены в лаборатории Д. Нгуена исследовательского института Центров здоровья Университета Макгилла (MUHC). Все анализы были подготовлены с использованием дистиллированной воды UltraPure, не содержащей ДНКазы/РНКазы (Thermo Fisher Scientific).

Праймеры и зонды

Праймеры RT-LAMP для SARS-CoV-2, использованные в этом исследовании, были разработаны Yu et al.³² нацелиться на РдРп ген в ORF1ab генома (рекомендован ВОЗ в качестве целевого гена для обнаружения SARS-CoV-2)³¹. Селективность праймера была подтверждена экспериментом по гель-электрофореза (дополнительная фиг. 16a). Составы и концентрации праймеров указаны в дополнительной таблице. 6.

Праймеры RT-LAMP для H1N1 были разработаны с помощью инструмента проектирования праймеров LAMP New England Biolabs, нацеленного на высококонсервативные последовательности гена гемагглютинина (HA) H1N1 IAV. Часть распознавания LAMP была оценена с помощью инструмента поиска базового локального выравнивания.⁵⁰, и никаких изменений последовательности не было обнаружено в 100 обращениях, предоставленных веб-сайтом Национального центра биотехнологической информации. Номинированные праймеры LAMP были выбраны в соответствии с оптимизированными параметрами, предлагаемыми протоколом Primer Explorer V5. Селективность праймеров была дополнительно подтверждена экспериментом по гель-электрофореза (дополнительная фиг. 16b). Составы и концентрации праймеров указаны в дополнительной таблице. 7.

Сайты мутаций P681H и L452R определяли с помощью инструментов CoV-GLUE-Viz и GISAID.^36,51и части распознавания PLP были разработаны так, чтобы быть специфичными для мутаций.³⁶. Кроме того, целевым местом PLP для обнаружения SARS-CoV-2 дикого типа был РдРп ген, который является тем же сайтом нацеливания для праймеров LAMP SARS-CoV-2. PLP сконструированы таким образом, что SNP отличается тем, что находится выше PLP, который обеспечивает 3'-гидроксильную группу в месте соединения лигирования, спаренную основаниями рядом с фосфорилированным 5'-концом целевой цепи. Достоверность циркуляризации PLP при обнаружении SNP была определена с использованием калькулятора температуры термостабильной лигазной реакции, предоставленного New England Biolabs. После этого PLP оценивались с использованием веб-сервера Mfold, чтобы избежать нежелательной вторичной структуры, особенно в сайте распознавания PLP. Прямой и обратный праймеры RCA были разработаны для гибридизации со спейсерной частью PLP, которая в целом соединяет два конкретных плеча PLP. Селективность PLP была подтверждена с помощью эксперимента по гель-электрофорезу (дополнительная фиг. 21). Композиции и концентрации PLP, а также композиции и концентрации праймеров RCA и состав кДНК доступны в дополнительных таблицах. 8–10.

Бактериальные праймеры LAMP, использованные в этом исследовании, были разработаны Hill et al.⁵² для ориентации на кишечная палочка MalB ген и Chen et al.⁵³ для борьбы с MRSA МЕКА ген. Составы и концентрации праймеров указаны в дополнительных таблицах. 11 и 12.

Подготовка к анализу

Для анализов RT-LAMP использовали стандартный реакционный объем 20 мкл. Этот объем состоял из смеси праймеров 2 мкл × 10, основной смеси 10 мкл × 2, 7 мкл воды, не содержащей РНКазы, и 1 мкл образца РНК. Образцы вируса, инактивированные нагреванием, сначала подвергали термическому лизису при 95°C в течение 3 минут, а затем смешивали с анализом. За этим следовала инкубация при 65°C в течение разных периодов времени, чтобы визуализировать изменение цвета во времени для разных образцов.

Реакцию лигирования PLP проводили в конечном объеме 10 мкл, включая 1 мкл синтетической кДНК генома РНК SARS-CoV-2, 1 мкл 1 мкМ PLP, 2 мкл дистиллированной воды UltraPure и 5 мкл ×2 но-трис-HCl HiFi. Раствор для лигирования Taq ДНК-лигазы (20 мМ MgCl₂, 20 мМ KCl, 2 мМ НАД, 0.1% Triton X-100, 20 мМ DTT, pH 8.50) и 1 мкл фермента HiFi Taq ДНК-лигазы. Смесь для лигирования сначала инкубировали при 95 °C в течение 5 минут для денатурации ДНК, а затем охлаждали до температуры отжига PLP (которая составляет 60, 58 и 55 °C для P681H, L452R и WT PLP соответственно), чтобы позволить PLP гибридизоваться с кДНК и лигировать с помощью фермента HiFi в термоциклере (Analytik Jena). После этого в реакции лигирования использовали 12 мкл мастер-микса WarmStart Colorimetric LAMP ×2 и 1.6 мкМ обратного и прямого праймеров RCA в конечном объеме 24 мкл. Реакцию амплификации RCA проводили при 65 °C в течение разных периодов времени, чтобы визуализировать изменение цвета во времени для разных образцов.

Для выделения бактериальной ДНК E. палочки образцы культивировали в течение ночи при 37 °C в среде бульона Лурии. Концентрацию бактерий определяли с помощью спектрофотометра Spectronic 21D. Аликвоты разной концентрации по 10⁷ КОЕ мл^-1, 10 ⁵ КОЕ мл^-1, 10 ⁴ КОЕ мл^-1, 10 ³ КОЕ мл^-1, 10 ² КОЕ мл^-1 и 10 КОЕ мл^-1 были подготовлены путем приостановки E. палочки культуры в средах с бульоном Лурии. E. палочки ДНК экстрагировали кипячением культур при 95°С в течение 10 мин. ДНК MRSA была получена в Центре здоровья Университета Макгилла методом химического лизиса. Концентрации всех образцов ДНК измеряли с использованием спектрофотометра Nanodrop 2000 и суспендировали в универсальном буфере 48 (Bio Basic) для достижения желаемых концентраций.

Анализ QolorEX на SARS-CoV-2 протестировал растворы с добавлением (вода, не содержащая РНКазы, и здоровая слюна) в количестве 8 × 10.⁵ РНК копирует мкл^-1 до 5 копий РНК мкл^-1 РНК SARS-CoV-2 и 90 мкл вирусных частиц^-1 до 0.01 вирусных частиц мкл^-1 для SARS-CoV-2, инактивированного нагреванием, соответствует биологически значимому диапазону. Аналогично исследование было проведено для Delta B.1.617.2, Omicron B.1.1.529, Omicron BA.4, Omicron BA.2.21, Omicron BA.5.2, Omicron BA.5.1.1, Eta B.1.525 и Gamma P. .1 с 8 × 10⁵ РНК копирует мкл^-1 в 10⁴ РНК копирует мкл^-1.

В анализе QolorEX на H1N1 изучались растворы с добавлением (вода, не содержащая РНКазы, и здоровая слюна) в количестве 8 × 10⁵ РНК копирует мкл^-1 до 5 копий РНК мкл^-1 РНК гриппа А H1N1. Для исследований селективности использовали РНК нескольких вирусов (SARS-CoV-2, MERS-CoV и HCoV-229E) при 8 × 10⁵ РНК копирует мкл^-1.

Анализ QolorEX для E. палочки исследованные растворы с добавлением (вода, не содержащая РНКазы) 7.2 × 10⁶ гДНК копирует мл^-1 до 7.2 копий гДНК мл^-1, что эквивалентно 0.0343 нг мкл^-1 до 3.43 × 10^-8 нг мкл^-1 of E. палочки ДНК. Для исследований селективности ДНК нескольких бактерий (E. палочки, МРЗС и П. палочка) испытывали в концентрации 10² гДНК копирует мкл^-1.

С помощью анализа QolorEX на MRSA изучали растворы с добавлением (вода, не содержащая РНКазы) 10⁵ гДНК копирует мл^-1 до 1 копии гДНК мл^-1, что эквивалентно 3.05 × 10^-4 нг мкл^-1 до 3.05 × 10^-9 нг мкл^-1 ДНК MRSA. Для исследований селективности ДНК нескольких бактерий (MRSA, E. палочки и П. палочка) испытывали в концентрации 10² гДНК копирует мкл^-1.

Анализ QolorEX RCA проводился в растворах с добавлением (вода, не содержащая РНКазы, и здоровая слюна) в количестве 8 × 10⁵ кДНК копирует мкл^-1 до 5 копий кДНК мкл^-1 синтетической кДНК последовательностей P681H, L452R и WT SARS-CoV-2. Селективность P681H PLP оценивали в присутствии кДНК P681H, WT-P681H и L452R. Ту же самую стратегию использовали для тестирования селективности L452R PLP с использованием мишеней кДНК L452R, WT-L452R и P681H, а также WT PLP в присутствии последовательностей кДНК WT, P681H и L452R. Все мишени кДНК оценивали в концентрациях 10⁵ кДНК копирует мкл^-1.

Автоматизированный блок обработки образцов и визуализации QolorEX

Портативная установка для визуализации состоит из трех основных компонентов: установки для визуализации с эпи-освещением, модуля обработки жидкостей и компонентов автоматизации (дополнительный рис. 1). Внешний корпус установки полностью изготовлен методом 3D-печати методом наплавления (Prusa I3 Mk3, Prusa) с разрешением слоя 0.3 мм.

Установка для визуализации с эпи-освещением была разработана для регистрации колориметрических изменений аналитического раствора. Установка формирования изображения имеет модуль освещения и модуль захвата и обработки изображений. Объектив ×20 (TU Plan Fluor EPI ×20, Nikon) использовался в качестве конденсорной линзы для захвата изображения. Все использованные оптические компоненты были закуплены у Thorlabs. Окончательное изображение проецируется на CMOS-сенсор (Sony IMX477R, 12.3 МП, Raspberry Pi) и далее обрабатывается Raspberry Pi 4 (Raspberry Pi).

Для автоматизации процесса мы использовали пять линейных приводов (Actuonix), которые выполняют несколько этапов обработки жидкости (дополнительные рисунки. 1–3). В установке используется нагревательный модуль, представляющий собой портативный паяльник (ТС-100) для лизиса образца. Ан XY Стадия перевода использовалась для сканирования различных внутри- и межобластей камер обнаружения. Мы использовали линейную компьютеризированную ступень с числовым программным управлением, которая приводится в движение шаговым двигателем (FUYU). И система привода, и сцена управляются микроконтроллером Arduino UNO (Arduino). Два нагревательных элемента управляются двухканальным релейным модулем (Ижет). Автоматизированную передачу и анализ данных в нашей системе контролирует микроконтроллер Raspberry Pi 4 (Raspberry Pi). Результаты отображаются в приложении, разработанном MIT App Inventor (дополнительный рис. 2).

Изготовление микрофлюидных картриджей и плазмонных платформ

Процесс изготовления следовал установленному протоколу.^27,54,55 и подробно описано в Дополнительная информация (Дополнительный рис. 5). Вкратце, микрофлюидный картридж основан на шестидюймовой кремниевой пластине. Трехэтапный процесс литографии используется для формирования рисунка затрудненного нагревательного элемента и микрофлюидных элементов. Сначала выполняется этап литографии для переноса элементов нагревателя (ширина 400 мкм) и площадки (длина 5 мм; ширина 2 мм) на слой фоторезиста через фотомаску с желаемыми узорами. За этим следует травление забуференным оксидом для удаления естественного оксида и травление гидроксидом калия для травления кремния при длине волны 200 нм. Затем выполняется процесс отрыва для выборочного нанесения нагревательных элементов в вытравленные канавки. Это начинается со второго этапа литографии, за которым следует электронно-лучевое осаждение алюминия толщиной 240 нм с использованием Temescal BJD 1800. Соответственно, отрыв завершается погружением в подходящее средство для удаления. Затем выполняется последний этап литографии для формирования модели элементов жидкостного устройства, включая впускные/выпускные порты (диаметр 2 мм), камера лизиса (длина 1.74 мм; ширина 1.5 мм; глубина 50 мкм), каналы смешивания (ширина 200 мкм; высота 50 мкм) и плазмонное окно (длина 1.94 мм; ширина 1.5 мм; высота 50 мкм) в слой СУ-8 (СУ-8 2050). Затем шестидюймовую пластину разрезают на отдельные чипсы (длина 26.5 мм; ширина 35 мм) с помощью нарезной пилы Disco DAD 3240.

За этим следует интеграция цветочувствительных платформ в микрофлюидный картридж с использованием технологии наноструктурирования без фабрики. Общий подход используется для создания коллоидного самосборочного монослоя наночастиц на границе раздела вода-воздух.⁵⁶. Затем полученные сотовые структуры передаются в камеру определения цвета микрофлюидного картриджа. Затем наносится тонкая пленка ZnO (120 нм), а затем тонкий слой Al (10 нм), чтобы обеспечить настраиваемый локализованный поверхностный плазмонный резонанс на белом фоне.

Полидиметилсилоксан (ПДМС) получают с использованием соотношения эластомера к сшивающему агенту 10:1, дегазируют в эксикаторе и инкубируют при 65°C в течение ночи. Отвержденный ПДМС разрезают по размеру микрофлюидного картриджа, а входные/выходные порты пробивают с помощью перфоратора ПДМС (Thermo Fisher Scientific) и используют для герметизации устройств. Процесс герметизации включает 50-секундную обработку плазмой с последующей инкубацией в течение ночи при 105 °C. Затем слой присоски на основе ПДМС был изготовлен с использованием форм для стереолитографии (SLA) 3D-печати (форма 3, Formlabs). Присоски впоследствии были прикреплены к жидкому слою ПДМС с помощью плазменно-активируемого соединения.

Картриджи для обработки проб (изготовленные с использованием 3D-принтера SLA с разрешением 50 мкм на z ось) прикрепляются к микрофлюидному чипу, покрытому PDMS, с помощью двусторонней ленты, способствующей плазмоактивируемому соединению, и помещаются в печь при 95 ° C на 90 минут. В картридже, напечатанном на 3D-принтере, имеются две металлические латунные вставки (McMaster Carr) для лизиса проб.

Обработка изображений

Обработка изображений начинается с набора данных, состоящего из трех повторов изображений для каждого изучаемого состояния, которые будут разделены на мини-изображения для создания в общей сложности 40 и 60 точек данных для каждого состояния для чувствительности и селективности соответственно. Специально для клинических образцов каждый из них изучался в трех параллельных сборных камерах микрофлюидного чипа; поскольку все изображения сделаны в трех экземплярах, а затем разделены, для каждого образца пациента было изучено в общей сложности 90 точек данных. Вся обработка изображения состоит из обрезки внешних 20% исходного изображения RGB для удаления эффекта кофейного кольца.⁵⁷, за которым следует приложение синего фильтра, при котором пиксели со значением оттенка от 85 до 140 (синий диапазон) удаляются и заменяются средним значением остальной части изображения.⁵⁷. Затем изображение с синим фильтром подвергается пороговой обработке путем замены менее насыщенных на 25% пикселей средним значением остальной части отфильтрованного изображения. Наконец, обработанное изображение разрезается на части изображения, из которых извлекаются несколько функций, что является следствием реализации формул, подробно описанных в Сергиане.⁵⁸. Модификация, внесенная в формулы, заключается в замене интенсивности оттенков серого на интенсивность каждого канала RGB.⁵⁸. Всего из каждого фрагмента изображения извлекается 18 значений, соответствующих среднему значению цвета, стандартному отклонению, режиму, перекосу, энергии и энтропии для каждого из каналов RGB.

Для автоматизации реальных человеческих образцов мы внедрили контролируемый алгоритм машинного обучения, чтобы разделить изображения на два класса: незараженные и зараженные (дополнительный рис. 14). Была создана SVM с ядром радиальной базисной функции (RBF) с ее гиперпараметрами. C и гамма, оцененная с помощью байесовского поиска⁵⁹ и отсутствие переоснащения, подтвержденное пятикратной перекрестной проверкой. База данных для этого исследования включает 33 инфицированных и 15 неинфицированных контрольных больных; Для каждого образца исследования проводились в трех экземплярах, в общей сложности получали девять изображений за один момент времени. Наборы данных разделены на два класса: незараженные (отрицательные) и зараженные (положительные). Затем они делятся на отдельные обучающие и тестовые наборы. Обучающий набор состоит из двух третей векторов от пациентов 1, 7, 9, 11, 15, 19, 21, 23, 25, 29 и 31 и негативов 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 13 и 15; тестовый набор интегрируется оставшимися векторами. SVM прогнозирует, что каждый вектор тестового набора будет незараженным или зараженным.

Клинические образцы и этическое заявление

Мы получили образцы слюны через Биобанк реагирования на пандемию PRESERVE Сети университетского здравоохранения (UHN REB 20-5364 и McGill IRB № A03-M24-21B). 33 клинических образца SARS-CoV-2 были собраны у взрослых пациентов с такими симптомами COVID-19, как лихорадка, усталость и сухой кашель. Все образцы были деидентифицированы и дали положительный результат на SARS-CoV-2 с помощью RT-PCR. Кроме того, вирусную нагрузку оценивали с помощью qPCR (QuantStudio 12K Flex, Thermo Fisher Scientific). Последовательности праймеров qPCR представлены в дополнительной таблице. 13. Образцы были исследованы в учреждении уровня 2+, расположенном в Институте Леди Дэвис при Еврейской больнице общего профиля.

Электрохимические измерения

Электрохимические измерения проводили в стандартной трехэлектродной ячейке с использованием потенциостата/гальваностата Autolab PGSTAT204. В качестве рабочего электрода использовались плазмонные платформы, а электродами сравнения и противоэлектродами служили Ag/AgCl и платиновая проволока соответственно. Потенциал циклической вольтамперометрии находился в диапазоне от -1 до 1 В по сравнению с электродом сравнения со скоростью сканирования 50 мВ с.^-1. Измерение фотоответа проводилось с использованием метода хроноамперометрии в условиях прерывистого окружающего видимого света (циклы включения-выключения света, 5 с) при потенциале смещения 1 В по сравнению с Ag/AgCl в водном растворе для анализа амплификации нуклеиновых кислот (10 частей LAMP Master Смесь: 2 части исходного праймера ×10, 7 частей воды, свободной от РНКазы, и 1 часть образца целевой РНК).

характеристика

Для исследований по оптимизации плазмонных платформ использовались методы определения физических характеристик, включая атомно-силовую микроскопию (АСМ) и СЭМ. АСМ выполнялась с использованием оборудования Bruker MultiMode8, а СЭМ выполнялась с использованием сканирующего электронного микроскопа окружающей среды FEI Quanta 450.

Оптические характеристики были выполнены с помощью оборудования Lambda750 для ближнего инфракрасного-УФ-видимого диапазона, где измерения поглощения белого света в течение 60 минут амплификации проводились в диапазоне от 200 до 850 нм. Условия исследования включали накопление решений для моментов времени на платформе, где падающие и собранные световые лучи нормально падали на платформу. Фундаментальное распределение электрического поля платформы изучалось с использованием конечно-разностного модуля во временной области (v.8.21.1781, Lumerical Solutions). Основные характеристики потока жидкости и теплопередачи микрофлюидного картриджа были изучены с использованием COMSOL Multiphysicals (v.5.6).

статистический анализ

Результаты представляются как среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения для трехкратных измерений, как описано в разделе обработки изображений. Для статистического анализа использовали пакет программ OriginPro (OriginLab, 2021). Пределы обнаружения и линейные диапазоны рассчитывались с использованием методов линейной регрессии, включая наклон линии и стандартную ошибку пересечения. Статистическую значимость оценивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с апостериорным критерием Тьюки для сравнения средних значений. Разница в наборах данных считалась статистически значимой для P < 0.001. Для построения графиков использовалось графическое приложение Paired Comparison Plot (v.3.60, OriginLab), используя консервативные P значения.

Отчетная сводка

Дополнительная информация о дизайне исследований доступна в Резюме отчета по портфелю природы ссылка на эту статью

• SEO-контент и PR-распределение. Получите усиление сегодня.
• ПлатонАйСтрим. Анализ данных Web3. Расширение знаний. Доступ здесь.
• Чеканка будущего с Эдриенн Эшли. Доступ здесь.
• Покупайте и продавайте акции компаний PREIPO® с помощью PREIPO®. Доступ здесь.
• Источник: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01384-5