In Vivo בזמן אמת מעקב אחר פליטת פוזיטרון (PEPT) ו-PET של חלקיקים בודדים - Nature Nanotechnology

הועלה מחדש על ידי אפלטון

עוקב: 0

כל הריאגנטים שימשו כפי שהתקבלו אלא אם צוין אחרת. כל הכימיקלים נרכשו מ-Sigma Aldrich מלבד חרוזי הספירה (CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen). ζ-הפוטנציאל נמדד באמצעות Zetasizer NanoZS90 (Malvern Instruments). גודל ומורפולוגיה של החלקיקים נחקרו על ידי SEM במיקרוסקופ JEOL JSM 7800F Prime עם EDS משולב כדי לספק את ניתוח היסודות. גודל החלקיקים נקבע על ידי מדידת 50 חלקיקים עצמאיים. כרומטוגרפיה מיידית בשכבה דקה רדיו (ITLC) פותחה על נייר מיקרוסיבי זכוכית של Agilent Technologies ספוג בחומצה סיליקית ונותח באמצעות סורק Lablogic Flow-count TLC וגלאי צינור מכפיל צילום (PMT) BioScan B-FC-3200 באמצעות תוכנת Laura. השלב הנייד של ITLC הורכב מ-0.175 M חומצת לימון ו-0.325 M טריסודיום ציטראט במים, אלא אם צוין אחרת. דגימות רדיואקטיביות נמדדו באמצעות Capintec CRC-25R (Capintec) או LKB Wallac 1282 Compugamma CS (PerkinElmer) שעבורם נאספו נתונים באמצעות תוכנת EdenTerm. ניסויי ציטומטריית זרימה בוצעו בסדרן תאי BD FACSMelody באמצעות תוכנת BD FACSChorus. תמונות PET/CT נרכשו באמצעות סורק NanoPET/CT (Mediso), שוחזרו באמצעות תוכנת Nucline v.0.21, ותמונות נותחו באמצעות תוכנת VivoQuant (גרסה 3.5, InviCRO). נתוני Listmode התקבלו על ידי כלי תוכנה ספציפי של MATLAB שפותח על ידי Mediso. אוטורדיוגרפיה בוצעה במכשיר GE Amersham Typhoon.

סינתזה של חלקיקי סיליקה בגודל תת-מיקרומטר

החלקיקים סונתזו בשיטת Stöber. שיטה זו מבוססת על הידרוליזה ועיבוי רצוף של סיליקון אלקוקסידי לייצור חלקיקי סיליקה כדוריים מונו-פזרים.²⁷. טטראתיל אורתוזיליקט (TEOS) שימש כמקור סיליקון, אמוניה כזרז בסיס ואשלגן כלורי כאלקטרוליט. תמיסה של TEOS באתנול נוספה ברציפות לתמיסה המכילה את הזרז והאלקטרוליט. שינוי בכמות ההתחלתית של המגיב או בקצב ההוספה מספק הבדלים בגודל החלקיקים כפי שדווח בעבר²⁸. כאן הוכנו שתי תמיסות לפני הסינתזה של החלקיקים: תמיסה 1 המכילה 19.0 מ"ל של TEOS ב-33.3 מ"ל של EtOH ותמיסה 2 המכילה 0.23 מ"ל של KCl ב-9 מ"ל אמוניה, 65 מ"ל של EtOH ו-6.75 מ"ל₂O. עבור הסינתזה, פתרון 2 הונח בבקבוק של 250 מ"ל עם תחתית עגולה שחומם ל-50 מעלות צלזיוס תחת ערבוב ב-300 סל"ד למשך 15 דקות. לאחר מכן, פתרון 1 נוספה טיפה לפתרון 2 (קצב אספקה 0.2 ml min.^-1). לאחר הוספת תמיסה 1, החלקיקים שהתקבלו טוהרו על ידי צנטריפוגה ב-18,300g למשך 3 דקות ונשטף עם EtOH חמש פעמים. לבסוף, ה-SiO₂ מיקרו-חלקיקים יובשו תחת ואקום.

השתלה של חלקיקים בגודל תת-מיקרומטר עם סילאן-PEG_5k

20 מ"ג מ"ל^-1 תמיסה של סילאן-PEG_5k (Sigma Aldrich) ב-EtOH 98% נוספה על תמיסה של smSiP ב-5 mg ml^-1 ב-EtOH 98% ו-2.8% אמוניה. התערובת עורבלה במשך הלילה בטמפרטורת החדר, והחלקיקים הוחזרו על ידי צנטריפוגה ב-18,300g למשך 3 דקות לבסוף, החלקיקים נשטפו שלוש פעמים במים מזוקקים ויובשו תחת ואקום למשך הלילה. תמיסות הכביסה יובשו בהקפאה למשך הלילה והכמות של סילאן-PEG לא מחובר_5k משוקלל עבור חישוב תשואת התגובה. A 0.05 mg ml^-1 פתרון של smSiP–PEG_5k במים מזוקקים נעשה שימוש לתגובות רדיו תיוג נוספות.

[⁶⁸Ga]GaCl₃

גליום-68 נפלט כמו [⁶⁸Ga]GaCl₃ מאת אקרט וזיגלר ⁶⁸Ge/⁶⁸מחולל GA ב-HCl טהור במיוחד (4 ml, 0.1 M) המיוצר לפי דרישות נהלי ייצור תקין (ABX).

ריכוז של [⁶⁸Ga]GaCl₃ פליטה על ידי חילופי קטונים

ריכוז החלוקה בוצע באמצעות ההגדרה המתוארת באיור משלים. 1. ראשית, 4 מ"ל של [⁶⁸Ga]GaCl₃ eluate הועמסו על מחסנית Strata-X-C 33u (Phenomenex) וה-eluate הושלך. לאחר מכן, המחסנית נשטפה עם 5 מ"ל של תמיסת אצטון/0.1 M HCl (80:20) והאלואט הושלך. לבסוף, המרוכז [⁶⁸Ga]GaCl₃ נאסף על ידי הוספת 700 µl של תמיסת אצטון/0.05 M HCl (98:2), מיובש תחת N₂ זרם והושעה מחדש ב-50 µl של חיץ HEPES של 0.5M, (pH 4.9). רדיו-TLC בוצע בשלבים השונים לצורך בקרת איכות. הפרוטוקול לוקח בערך 20 דקות ומספק תשואה התאוששות של 86.2 ± 8.5%.

סימון רדיו של חלקיקי סיליקה בריכוזים שונים עם ⁶⁸Ga

חלקיקי סיליקה הושעו מחדש בריכוזים שונים (מ-1 עד 0.002 mg ml^-1) במאגר HEPES של 0.5 M (pH 4.9). לאחר מכן, 50 µl מהתמיסה הוספו לצינור תגובה לפני הוספת המרוכז [⁶⁸Ga]GaCl₃ אלוציה ב-50 µl של חיץ HEPES של 0.5M (pH 4.9). התגובות נערכו ב-90 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ורדיו-TLC בוצע כדי לחשב את התשואה הרדיוכימית.

מדידת ריכוז החלקיקים על ידי ציטומטריית זרימה

ריכוזי החלקיקים חושבו על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות חרוזי ספירה (CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen) בהתאם להוראות היצרן. חלקיקי סיליקה הושעו מחדש ב-0.05 mg ml^-1, עבר צלילים למשך 10 דקות והועבר דרך מסנן בגודל חתך של 10 µm (מסנן מזרק KX, ניילון, 25 מ"מ, 10 µm). חרוזי ה-CountBright Absolute Counting Beads חוממו לטמפרטורת החדר והוסבבו במשך 30 שניות. לאחר מכן, 50 µl של חרוזים נוספו ל 300 µl של חלקיקי סיליקה והתערובת עברה מערבולת במשך 30 דק' לקבלת תמיסה הומוגנית. הדגימה הופעלה על ציטומטר הזרימה וסף הפיזור קדימה (FSC) מוגדר כך שיכלול את החרוזים והחלקיקים במגרש הפיזור ליניארי-FSC לעומת צד ליניארי. לאחר מכן, מתח גלאי הקרינה הותאם עבור חרוזי הספירה ובוצעה אסטרטגיית שער לבידוד חלקיקי הסיליקה ואוכלוסיות חרוזי הספירה. לבסוף צוירו שערים על החלקיקים וחרוזי הספירה המוחלטים ונרשמו 1,000 אירועי חרוזים עבור כל דגימה. באמצעות אסטרטגיה זו, מספר החלקיקים בתמיסה חושב באמצעות המשוואה הבאה:

$$begin{array}{l}displaystyle{mathrm{Absolute}},{mathrm{count}},left(frac{mathrm{Particles}}{{{upmu l}}}right)=displaystylefrac{({mathrm{ חלקיקים}},{mathrm{count}},פעמים,{mathrm{Counting}},{mathrm{beads}},{mathrm{נפח}})}{({mathrm{Counting}},{mathrm{beads}} ,{mathrm{count}},פעמים,{mathrm{Particles}},{mathrm{נפח}})} פעמים,{mathrm{Counting}},{mathrm{beads}},{mathrm{ריכוז}}שמאלה(frac {{mathrm{Beads}}}{{{upmu l}}}ימינה)end{array}$$

תיוג רדיו של 500 smSiP

חמש מאות smSiP נוספו ל-50 µl של המרוכז [⁶⁸Ga]GaCl₃ אלוציה ב-0.5 M חיץ HEPES pH 4.9. לאחר מכן, נוספו 5.6 µl של polysorbate 80 והתערובת חוממה ל-90°C למשך 30 דקות ב-900 rpm במיקסר תרמי. לאחר מכן, תוכנן פרוטוקול טיהור מרובה-שלבי סופי כדי להסיר ללא תגובה/קולואיד ⁶⁸ג. נוספו חמישים מיקרוליטר של 10 מ"מ EDTA, והתערובת הודגרה 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, החלקיקים עברו צנטריפוגה למשך 3 דקות ב-18,300g, מושהה מחדש ב-500 µl של PBS המכיל 1 מ"מ EDTA + 0.1% פוליסורבט 80 ומעורבל בעדינות במשך 10 שניות. החלקיקים עברו צנטריפוגה שוב, נשטפו עם תמיסה של 0.1 mM EDTA + 0.1% פוליסורבט 80 ב-PBS והוסבבו בעדינות במשך 10 שניות. לבסוף, החלקיקים עברו צנטריפוגה ונשטפו חמש פעמים נוספות עם PBS + 0.1% פוליסורבט 80 והוקפאו מחדש ב-500 µl PBS. תגובת התיוג הרדיואקטיבי נוטרה על ידי רדיו-TLC במהלך שלבי התגובה העוקבים כדי להעריך את נוכחותם של קולואידים (שניתן לבלבל עם חלקיקים אם לא מוסרים כראוי), התיוג הרדיואקטיבי של החלקיקים וטוהר התוצר הסופי. RLY חושב על ידי השוואה בין כמות הרדיואקטיביות בחלקיקים והסופרנטנטים לאחר שלבי הכביסה.

שבר

עבור אסטרטגיית הפירוק, נפחים מ-0.5 µl עד 20 µl של ⁶⁸Ga-smSiP בריכוז תיאורטי של 1 חלקיק µl^-1 נוספו לצינורות דגימה שונים בשלבים של 1 µl (0.5, 1, 2, 3...) ו-PBS נוסף כדי להביא את הנפח הסופי ל-50 µl. לאחר מכן, 37.5 µl מהשפופרת הראשונה הוזרמו לפיפטה לצינור דגימה שני, 25 µl מהשפופרת השנייה לצינור שלישי ולבסוף 12.5 µl מהצינור השלישי לצינור רביעי. אסטרטגיה זו מספקת ארבע צינורות לדגימה עם נפח סופי של 12.5 µl לצינור. הרדיואקטיביות בכל צינור נמדדה במונה גמא והערכים חושבו ב-kBq באמצעות עקומת כיול, לצורך השוואה וניתוח נוסף. הדגימות המכילות את רוב הרדיואקטיביות בצינור אחד בלבד עברו צלילים למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר ועברו שלב שני של חלוקה. לאחר מכן, הדגימות שבהן נמצאה כל הרדיואקטיביות בצינור בודד (עם פעילות זניחה בשלושת הצינורות האחרים) שימשו לניסויים נוספים in vivo/ex vivo.

הדמיית פנטום PET/CT

ניסוי הדמיית פנטום בוצע עם אחד ⁶⁸Ga-smSiP. נעשה שימוש בצינורית כדי להעביר את החלקיק לתוך צינור דגימה כדי להעריך אם חלקיק בודד יכול להישאר לכוד בצינורית הצינורית במהלך המתן. בקצרה, צינור הפנטום הונח בסורק nanoPET/CT כשקצה קצה הצינורית מחובר לצינור. לאחר התחלת רכישת ה-PET, החלקיק שהופסק מחדש ב-100 µl של PBS נמסר עם מזרק אינסולין המחובר לתחילת הצינורית. לאחר מכן, הצינורית נשטפה עם 50 µl של PBS כדי להבטיח את אספקת החלקיק לתוך צינור הפנטום. רכישת ה-PET בוצעה במשך 2 שעות ולאחריה סריקת CT רגילה.

הדמיית PET/CT in vivo

מחקרי הדמיה של בעלי חיים נבדקו מבחינה אתית ובוצעו בהתאם לחוק בעלי חיים (נהלים מדעיים) משנת 1986 (ASPA) תקנות משרד הפנים של בריטניה המסדירים ניסויים בבעלי חיים. הדמיה In vivo נערכה בעכברי BALB/c בריאים בני 8 שבועות. בעלי חיים הורדמו עם איזופלורן (2-3% בחמצן), עברו צינורית והונחו על מיטת הסורק תחת הרדמה. המיטה חוממה ל-37 מעלות צלזיוס על ידי זרימת אוויר פנימית כדי לשמור על החיה בטמפרטורת גוף רגילה, וקצב הנשימה נוטר ונשמר ב-60-80 נשימות דקות.^-1 לאורך כל הסריקה. שמירה על שליטה על טמפרטורת החיה חשובה, שכן ירידה בלתי צפויה בטמפרטורה עלולה להוביל להפחתה במהירות החלקיק בדם. אחד ⁶⁸Ga-smSiP (n = 4) או ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k חלקיק (n = 2) ניתנה דרך הצינורית ב-100 µl של PBS, ולאחר מכן כביסה עם 50 µl PBS לאחר התחלת רכישת ה-PET (מצב צירוף מקרים 1:5; חלון זמן צירוף של 5 ns). PET תועד במשך 2 שעות, ולאחר מכן בוצעה סריקת CT חצי עיגול. טמפרטורת גוף וקצב הנשימה של בעלי חיים נוטרו במהלך כל התהליך. תמונות PET/CT דינמיות שוחזרו באמצעות שחזור תלת-ממד של Tera-Tomo (חלון אנרגיה של 3-400 keV, מצב צירוף מקרים של 600:1, 5 איטרציות ותת-קבוצה אחת) בגודל ווקסל של 20 × 1 × 0.4 mm³ ותיקן להנחתה, פיזור וריקבון. ניתן למצוא נתוני מצב רשימה עבור כל רכישות PET/PEPT עבור ⁶⁸Ga-smSiP ב-ref. ²⁹ ועבור ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k ב- ref. ³⁰.

מעקב בזמן אמת

ראשית, נתונים יוצאו מהסורק בפורמט listmode (כלומר, פורמט עם חותמת זמן ואינדקס גביש לפוטוני צירוף מקרים שזוהו). טרנספורמציה גיאומטרית הוחלה כדי להמיר מדדי גביש למיקום ביחידות מ"מ. שיטת בירמינגהם מחשבת באופן איטרטיבי את ה-MDP מתוך תת-קבוצה של כל ה-LoRs. הוא עושה זאת על ידי השלכת LoRs שנמצאים רחוק יותר ממרחק מוגדר מה-MDP, שכן אלה עשויים להיווצר מ-LoRs שקריים, למשל, LoRs שעשויים לנבוע מפיזור. ה-MDP מתעדן עם כל איטרציה; מספר האיטרציות נקבע למעשה על ידי f-גורם ומתייחס למספר הכולל של LoRs המשמשים להערכת מיקום החלקיקים הסופי בתוך אותה תת-קבוצה (לדוגמה, f-פקטור של 0.5 אומר שלולאת האיטרציה תסתיים כאשר נותרו 50% מה-LoRs בתת-הקבוצה). ניתן להקטין את מספר ה-LoRs בשימוש בתת-קבוצה כדי לשפר את הדגימה הזמנית (תת-הקבוצות הן רצופות זמן ללא חפיפה) במחיר של הגדלת אי הוודאות במיקום (פרטים נוספים על האלגוריתם ניתן למצוא ב- Parker et al.⁵) שיטת ברמינגהם שימשה לניתוח נתוני מצב רשימה מסורק PET. נעשה שימוש בגודל מדגם אדפטיבי כדי לעקוב אחר החלקיק בעכברים. גודל המדגם נקבע כדי להשיג איזון של מספיק דגימה זמנית תוך מזעור שגיאות מיקום. גודל מדגם בין 100 ל-200 LoRs שימש בשלבים המוקדמים של הסריקות (<60 שניות מתחילת הסריקה), עם f = 0.1, מניב מרווחים של כ-1-5 שניות. בזמני סריקה מעל 60 שניות, גדלי המדגם השתנו בין 1,000 ל-2,000, מה שהניב מרווחי זמן של בין 30 שניות ל-60 שניות בהתאם לניסוי in vivo. ניתן למצוא את מספר הספירות המשמשות לחישוב ה-MDP (באיטרציה הסופית) על ידי הכפלת גודל המדגם ב- f-ערך גורם. פרמטרים אלו התבססו על נסיון קודם והודע על ידי פרסומים קודמים¹.

מהירות הושגה כ (sqrt{{v}_{x}^{2}+{v}_{y}^{2}+{v}_{z}^{2}}) איפה ({v}_{m}^{2}) היא המהירות ב- x, y ו z הוראות.

קליטת איברים לשעבר

הספיגה באיברים שונים הוערכה על ידי ספירת גמא. לאחר הדמיית PET/CT in vivo, בעלי חיים נהרגו על ידי פריקת צוואר הרחם ואיברים נכרתו ונשקלו לצורך ספירת רדיואקטיביות במונה גמא (LKB Wallac 1282 Compugamma CS). הנתונים הובאו כאחוז מינון מוזרק (מינון באיבר/מינון כולל המוזרק) לגרם רקמה (%ID g^-1).

אוטורדיוגרפיה

הרדיואקטיביות בריאות אותרה בעזרת גלאי קרינה (בדיקה EP15, מורגן), והריאות נחתכו למקטעים קטנים עם אזמל עד שהתקבל חלק קטן של רקמה עם האות הרדיואקטיבי. הרקמה הוקפאה במהירות באיזופרופנול -80 מעלות צלזיוס. מיד לאחר ההקפאה, הרקמה הוטבעה במדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלית ונחתכה בקריוסטט בפרוסות של 20 מיקרומטר. כל פרוסה נסקרה עם הגלאי עד שנמצאה הפרוסה הרדיואקטיבית. הפרוסה הקודמת (מתחת לרקע), הרדיואקטיבית והאחרת (מתחת לרקע) הונחו על שקופית מיקרוסקופ Superfrost (Epredia). שאר הרקמה הנותרת הייתה גם מתחת לרקע. שקף המיקרוסקופ עם שלושת החלקים היה מכוסה בניילון נצמד ומנוגד לצלחת אוטורדיוגרפיה של GE בן לילה. הצלחת נותחה באמצעות GE Amersham Typhoon עם רזולוציה של 25 µm והגדרת PMT של 4,000. תמונת האוטורדיוגרפיה הונחה על תמונת הרקמה, והראתה נקודה אחת של רדיואקטיביות בפרוסה הרדיואקטיבית. לצורך הכימות, הוכנו תקנים בפעילויות ידועות שונות, וכל אחד מהם זוהה כחמישייה של 1 µl בנייר. הכתמים הודגרו באותו מסך אחסון זרחן, BAS-IP MS (Multipurpose Standard) מבית GE כפי שכמתו את החלקיקים הבודדים. התמונה נרכשה עם Amersham Typhoon 5 עם תוכנת השליטה בגרסה 2.0 במצב פוספור בגודל פיקסל של 100 µm ורגישות של 4,000. התמונות כומתו עם התוכנה ImageQantTL v10.0-261 באמצעות ארגז הכלים לכימות ג'ל. הכתמים תוקנו על ידי בחירת אזור מיד לפני או אחרי הנקודה כרקע קבוע. הנפח שנוצר של הנקודה שימש לחישוב ה-Bq בחלקיק על בסיס עקומת הכיול.

סטטיסטיקה ושחזור

לצורך ניתוח כמותי, נותחו לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים, למעט נתוני in vivo של ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k (n = 2). הנתונים נותחו על ידי ניתוח חד-כיווני רגיל של שונות (ANOVA) עם מבחן ההשוואות המרובות של דנט ו- Student's t-מִבְחָן. א P ערך <0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.