میکروالکترودهای لایه نازک مبتنی بر گرافن نانومتخلخل برای ضبط و تحریک عصبی با وضوح بالا In Vivo - نانوتکنولوژی طبیعت

بازنشر افلاطون

دنبال: 0

آماده سازی مواد و خصوصیات

محلول آبی GO در آب دیونیزه رقیق شد تا 0.15 میلی گرم در میلی لیتر به دست آید.^-1 محلول و خلاء از طریق یک غشای نیتروسلولزی با منافذ 0.025 اینچ فیلتر شده و یک لایه نازک از GO را تشکیل می دهد. سپس لایه نازک با استفاده از انتقال مرطوب در آب دیونیزه و بازپخت حرارتی بیشتر در دمای 100 درجه سانتیگراد به مدت 2 دقیقه به زیرلایه مورد نظر منتقل شد. پشته فیلم- بستر GO در دمای 134 درجه سانتی گراد در اتوکلاو استاندارد به مدت 3 ساعت به صورت هیدروترمال کاهش یافت تا EGNITE تشکیل شود. بستر پایه برای تمام مطالعات خصوصیات EGNITE یک مربع (1 × 1 cm بود²) از Si/SiO₂ (400μm/1μm).

XPS

اندازه گیری XPS با یک آنالایزر Phibos 150 (SPECS) در شرایط خلاء فوق العاده بالا (فشار پایه، 5 × 10) انجام شد.^-¹⁰ mbar) با یک منبع پرتو ایکس AlKα تک رنگ (1,486.74 اینچ eV). طیف های اجمالی با انرژی عبور 50 ولت و اندازه گام 1 اینچ ولت و طیف های با وضوح بالا با انرژی عبور 20 ولت و اندازه گام 0.05 ولت به دست آمدند. وضوح کلی در این شرایط آخر 0.58 اینچ eV است، همانطور که با اندازه گیری عرض کامل در نصف حداکثر Ag 3 تعیین می شود.d5/2 قله نقره پاشیده شده. تجزیه و تحلیل XPS کاهش شدیدی را پس از تیمار هیدروترمال پیک C-O (مرتبط با گروه های اپوکسید) نشان می دهد، اما سهم کمی از C-OH، C=O و C(O)OH به دلیل هیدروکسیل ها، کربونیل ها و کربوکسیل ها است. پس از کاهش باقی می ماند. دکانولوشن O1s پیک چنین رفتاری را تایید می کند. سهم اصلی در C1s سیگنال پس از کاهش هیدروترمال، با این حال، از sp² اوربیتال های C-C هیبرید شده^34,57.

پراش اشعه ایکس

اندازه گیری پراش اشعه ایکس (θ-2θ اسکن) در یک پراش سنج تحقیقاتی مواد (Malvern PANalytical) انجام شد. این پراش سنج افقی دارد ω-2θ گونیا متر (شعاع 320 میلی متر) در یک هندسه چهار دایره و کار با یک لوله اشعه ایکس سرامیکی با آند Cu Ka (λ = 1.540598 Å). آشکارساز مورد استفاده Pixcel است که یک آشکارساز سریع اشعه ایکس مبتنی بر فناوری Medipix2 است.

طیف سنجی رامان

اندازه‌گیری‌های طیف‌سنجی رامان با استفاده از طیف‌نگار Witec مجهز به خط تحریک لیزری 488 نانومتر انجام شد. برای اندازه گیری، طیف رامان با استفاده از یک شی 50 × و یک گریتینگ 600 شیار در نانومتر به دست آمد. برای جلوگیری از گرم شدن نمونه، توان لیزر زیر 1.5 میلی‌وات نگه داشته شد.

دارند

یک لاملا پرتو یون متمرکز با یک Helios NanoLab DualBeam (LMA-INA) برای مطالعه مقطعی نمونه EGNITE تهیه شد. آنالیزهای ساختاری با استفاده از TEM با استفاده از میکروسکوپ Tecnai F20 با ولتاژ 200 اینچ، از جمله تکنیک‌های HRTEM و تکنیک‌های STEM با میدان تاریک حلقوی بالا انجام شد. آزمایش STEM-EELS در یک میکروسکوپ Tecnai F20 که در 200 KeV کار می‌کرد، با دیافراگم 5 میلی‌متری، طول دوربین 30 میلی‌متر، زاویه همگرایی 12.7 mrad و زاویه جمع‌آوری 87.6 mrad انجام شد. از آنجایی که از 0.5 eV در هر پیکسل و 250 eV به عنوان انرژی آغازین در اکتساب از دست دادن هسته استفاده کردیم، لبه Si K مورد انتظار در 1,839 eV، Pt M-Edge در 2,122 eV و Au M-Edge در 2,206 اینچ eV. ترکیب اتمی C-O نسبی با متمرکز کردن توجه ما در لایه GO کاهش یافته و با فرض اینکه مجموع لبه های تجزیه و تحلیل شده (C و O در مورد ما) به 100٪ به دست آمده است. این فرض در مورد ما معتبر است همانطور که در اطلاعات تکمیلی نقشه ها. مقطع دیفرانسیل انرژی با استفاده از مدل Hartree-Slater و پس‌زمینه با استفاده از مدل کم توان محاسبه شد.

رسانایی الکتریکی

اندازه گیری هدایت الکتریکی با استفاده از منبع سنج Keithley 2400 در پیکربندی دو نقطه ای انجام شد. نمونه های اندازه گیری شده شامل فیلم های EGNITE 1 × 1 سانتی متری بودند² در بالای یک SiO₂ لایه.

تحلیل داده ها

داده های پراش اشعه ایکس، رامان و XPS با استفاده از بسته های پایتون 3.7 (Numpy، Pandas، Scipy، Xrdtools، Lmfit، Rampy، Peakutils، Matplotlib) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. فاصله بین هواپیماها بر اساس قانون اسنل از اندازه گیری پراش اشعه ایکس محاسبه شد. هنگامی که داده ها به حوزه فضایی منتقل شدند، حداکثر پیک ها برازش شد. فاصله مربوطه یک مقدار متوسط از فاصله بین هواپیماها را نشان می دهد. انحراف از آن مقادیر میانگین از عرض کامل در نصف حداکثر اتصالات لورنتزی قله در حوزه فضایی محاسبه شد. اندازه‌گیری‌های طیف‌سنجی XPS و رامان با برازش یک پیچیدگی از قله‌ها در مکان‌های مورد انتظار برای ویژگی‌های مربوطه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. مقادیر رسانایی GO و EGNITE با برازش به دست آمد I-V منحنی های اندازه گیری شده در اندازه گیری هدایت الکتریکی با قانون اهم. داده ها هستند n = 1 برای هر اندازه گیری.

ساخت آرایه انعطاف پذیر

ساخت دستگاه ها در شکل تکمیلی نشان داده شده است. 4. دستگاه ها بر روی 4 اینچ Si/SiO ساخته شدند₂ ویفر (400μm/1μm) ابتدا یک لایه PI به ضخامت 10 میکرومتر (PI-2611، HD MicroSystems) روی ویفر پوشانده شد و در اتمسفر غنی از نیتروژن در دمای 350 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه پخته شد. ردهای فلزی با استفاده از لیتوگرافی نوری مقاومت نوری معکوس تصویر (AZ5214، Microchemicals) الگوبرداری شدند. تبخیر پرتو الکترونی برای ته نشینی 20 نانومتر تیتانیوم و 200 نانومتر طلا استفاده شد و بلند کردن آن انجام شد. ما از یک فیلم EGNITE با ضخامت حدود 1 میکرومتر به عنوان یک مبادله بین عملکرد الکتروشیمیایی و انعطاف پذیری آرایه استفاده کردیم. پس از انتقال فیلم GO، آلومینیوم با پرتو الکترونیکی تبخیر شد و نواحی بالای ریزالکترودهای آینده با استفاده از مقاومت نور منفی (nLOF 2070، Microchemicals) مشخص شد و از بین رفت. در مرحله بعد، فیلم GO در همه جا جدا از ریزالکترودهای آینده با استفاده از اچینگ یون واکنش پذیر اکسیژن (RIE) به مدت 5 دقیقه در 500 اینچ وات و ستون های آلومینیومی محافظ با محلول رقیق اسیدهای فسفریک و نیتریک اچ شدند. سپس، یک لایه PI-3 به ضخامت 2611 میکرومتر بر روی ویفر گذاشته شد و همانطور که قبلا توضیح داده شد پخته شد. سپس دهانه های PI-2611 روی میکروالکترود با استفاده از یک مقاوم نوری ضخیم مثبت (AZ9260، Microchemicals) که به عنوان ماسکی برای RIE اکسیژن بعدی عمل می کرد، تعریف شد. بعداً دستگاه‌ها روی لایه PI الگوبرداری شدند، دوباره با استفاده از مقاومت نوری AZ9260 و RIE. سپس لایه مقاوم به نور در استون برداشته شد و ویفر در الکل ایزوپروپیل تمیز و خشک شد. در نهایت، دستگاه‌ها از ویفر جدا شدند و آماده قرار دادن در کیسه‌های استریل‌سازی شدند تا در دمای 134 درجه سانتی‌گراد در اتوکلاو استاندارد به مدت 3 ساعت تحت درمان هیدروترمال قرار گیرند.

مشخصات الکتروشیمیایی میکروالکترود

مشخصات الکتروشیمیایی ریزالکترودها با پتانسیواستات Metrohm Autolab PGSTAT128N در 1× PBS (Sigma-Aldrich, P4417) حاوی بافر فسفات 10 میلی‌مولار، NaCl 137 میلی‌مولار و غلظت 2.7/7.4 میلی‌مولار NaCl و 45093lº attrom، سه عنصر K. یک الکترود Ag/AgCl (FlexRef، WPI) به عنوان مرجع و یک سیم پلاتین (Alfa Aesar، XNUMX) به عنوان الکترود ضد استفاده شد.

قبل از ارزیابی عملکرد، الکترودها با 10,000 پالس متعادل بار (1 اینچ، 15µA) پالس شدند. قرار گرفتن الکترودها در معرض پروتکل های پالس پیوسته با 100 سیکل ولتامتری چرخه ای (0.9/0.8- تا 50/XNUMX+ ولت) در XNUMX میلی ولت بر ثانیه انجام می شود.^-1، 20 تکرار 5,000 پالس (1 اینچ) و تعیین مجدد پتانسیل مدار باز.

تحلیل داده ها

داده های مشخصات الکتروشیمیایی با استفاده از بسته های Python 3.7 (Numpy، Pandas، Scipy، Pyeis، Lmfit، Matplotlib) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. داده های طیف سنجی امپدانس به یک مدل الکتریکی معادل متشکل از یک مقاومت (R) به صورت سری با یک عنصر فاز ثابت (CPE). از آنجا، مقدار CPE به یک ظرفیت تخمین زده شد و بر ناحیه هندسی ریزالکترود تقسیم شد تا یک مقدار معادل برای ظرفیت سطحی EGNITE بدست آید. ظرفیت ذخیره بار میکروالکترود (CSC) از اندازه‌گیری‌های ولتامتری چرخه‌ای با ادغام رژیم‌های کاتدی و آندی جریان اندازه‌گیری‌شده و نرمال‌سازی با نرخ اسکن محاسبه شد. ظرفیت ذخیره بار کاتدی و آندی (cCSC و aCSC) در سرعت اسکن 100 میلی ولت EGNITE برابر با 45.9 ± 2.4 و 34.6 ± 2.8 mC cm است.^-2، به ترتیب (n = 3). همانطور که برای سایر مواد گزارش شده است⁵⁸، CSCهای به دست آمده به سرعت اسکن بستگی دارند (شکل تکمیلی 5). برای ارزیابی حضور واکنش‌های کاهش اکسیژن، شکل موج CV را در الکترولیت پاک‌شده با نیتروژن اندازه‌گیری کردیم.⁵⁹ و تفاوت قابل توجهی در شکل موج مشاهده نکرد (شکل تکمیلی. 6). با این حال، نتایج ما به طور کامل به تأثیر واکنش‌های کاهش اکسیژن در ظرفیت تزریق بار EGNITE نمی‌پردازد و برای بررسی صحیح این موضوع باید کارهای بیشتری انجام شود. ظرفیت تزریق بار میکروالکترود (CIC) با تعیین دامنه پالس جریان ایجاد شد که باعث ایجاد اختلاف ولتاژ (پس از حذف افت اهمی) شد که با پنجره آب الکتروشیمیایی الکترود مطابقت داشت (-0.9 ولت برای کاتدیک و + 0.8 ولت برای آندی در مقابل Ag/Ag). ) (شکل تکمیلی 17)⁶⁰.

تحلیل آماری

داده ها به طور میانگین ± s.d. n = 18 برای EIS و n = 3 برای کرونوپتانسیومتری ها. داده های نقشه گذر ولتاژ خازنی کاتدی، میانگین گذرهای ولتاژ خازنی کاتدی برای یک رویداد برای هر شکل پالس است. n = 3 الکترود.

ارزیابی پایداری مکانیکی

سونوگرافی اولتراسوند

آرایه های الکترود EGNITE در داخل یک بشر پر از آب در یک حمام آب اولتراسوند (Elmasonic P 180H) قرار داده شد. فراصوت در فرکانس 37 کیلوهرتز به مدت 15 دقیقه در 200 اینچ وات اعمال شد، و به دنبال آن 15 دقیقه فراصوت اضافی در 37 اینچ کیلوهرتز با توان افزایش به 300 اینچ وات انجام شد. تصاویر الکترودها قبل و بعد از مراحل فراصوت به دست آمد.

تست خمش

تنظیم خمش (شکل. 2k) از سه میله استوانه ای تشکیل شده است. وسط (قطر، 700 میکرومتر) پایین آمد و زاویه خمشی 131 درجه ایجاد کرد. سه آرایه میکروالکترودی انعطاف پذیر برای آزمایش خمش استفاده شد. هر آرایه حاوی 18 میکروالکترود با قطر 50 میکرومتر بود. دو آرایه بعد از 10 و 20 چرخه اندازه گیری شد در حالی که یک دستگاه فقط برای 10 چرخه اندازه گیری شد زیرا در حین جابجایی پس از اندازه گیری آسیب دید. چرخه آزمایش خمش شامل یک کاربرد بار 10 ثانیه ای به اضافه 10 ثانیه بدون بار بود. دستگاه ها قبل و بعد از 10 و 20 چرخه خمشی به صورت الکتروشیمیایی مشخص شدند (EIS و CV).

ضبط عصبی اپیکورتیکال

کاشت اپیکورتیکال

تمام مراحل آزمایشی مطابق با توصیه های شورای جامعه اروپا و قوانین فرانسه برای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی انجام شد. پروتکل ها توسط کمیته اخلاقی گرنوبل (ComEth) تایید و توسط وزارت فرانسه (شماره 04815.02) تایید شده است. موش های اسپراگ داولی (نر، 4 ماهه، وزن ~600 گرم) به صورت داخل عضلانی با کتامین (50 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم (وزن بدن)) و زایلازین (10 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم (وزن بدن)) بیهوش شد و سپس روی نگهدارنده استریوتاکسی ثابت شد. با برداشتن جمجمه گیجگاهی، قشر شنوایی در معرض دید قرار گرفت. دورا ماده برای جلوگیری از آسیب رساندن به بافت قشر مغز حفظ شد. یک سوراخ در راس برای وارد کردن الکترود مرجع حفر شد و یک سوراخ دوم، 7 میلی‌متر به سمت جلو نسبت به اولی، برای وارد کردن الکترود زمین ایجاد شد. الکترودها پین هایی به ضخامت 0.5 میلی متر بودند که برای سوکت های مدار مجتمع استفاده می شدند. آنها را برای برقراری تماس الکتریکی با سخت افزار قرار دادند و با سیمان دندانی به جمجمه ثابت کردند. سپس همانطور که در شکل نشان داده شده است، نوار میکروالکترود سطحی را روی قشر شنوایی نصب کردیم. 3b. الگوهای ورید قشر شنوایی را در ناحیه 41 نقشه مغز موش کریگ شناسایی می کنند. سیگنال های قشری به طور همزمان با بهره 1,000 تقویت شده و با نرخ نمونه برداری 33 کیلوهرتز دیجیتالی شدند. بلندگوی 20 سانتی متری جلوی گوش موش، در مقابل قشر در معرض آن، محرک های صوتی را ارسال می کند. محرک های ارائه شده توسط یک میکروفون 0.25 اینچی (Brüel & Kjaer, 4939) که در نزدیکی گوش قرار داده شده و در سطح فشار صدا (dB SPL re 20 μPa) قرار داده شده بود، نظارت شد. ما پاسخ‌های راس مثبت (منفی به بالا) با تأخیر متوسط را بررسی می‌کنیم که با کلیک‌های متناوب در SPL 80 دسی‌بل، و محرک‌های انفجاری تون در 70 دسی‌بل SPL با فرکانس‌های بین 5 تا 40 کیلوهرتز، زمان افزایش و سقوط 5 اینچ و مدت زمان 200 میلی ثانیه

تحلیل داده ها

داده‌های الکتروفیزیولوژیک با استفاده از بسته‌های Python 3.7 (Numpy، Pandas، Scipy، Neo، Elephant، Sklearn Matplotlib) و کتابخانه سفارشی PhyREC تجزیه و تحلیل شدند.https://github.com/aguimera/PhyREC). r.m.s. مقادیر با یک پنجره کشویی 20 میلی‌ثانیه در فرکانس‌های بالای 200 هرتز محاسبه شد. طیف‌نگارها برای محدوده‌ای بین 70 هرتز و 1.1 کیلوهرتز محاسبه شدند. PSD بیش از 60 ثانیه ضبط مداوم محاسبه شد. برای یک آرایه الکترود معین، دو PSD محاسبه شد: در داخل بدن (IV) و پس از مرگ (PM). SNR بر حسب دسی بل (20 × ln(r.m.s.(IV)/r.m.s.(PM))) بیان می شود و برای 20 نقطه به صورت لگاریتمی بین 10 Hz و 1kHz درون یابی می شود.

تحلیل آماری

داده های عصبی اپیکورتیکال ارائه شده در شکل. 3 از اندازه گیری های فردی روی یک حیوان گرفته می شود. در شکل 3cداده های 64 الکترود ارائه شده است. در شکل 3dداده های دو الکترود انتخاب شده ارائه شده است. در شکل 3f، PSD و SNR از 64 الکترود EGNITE محاسبه می شوند و به صورت میانگین ± s.d نشان داده می شوند. در شکل تکمیلی 12c,d داده های متوسط برای 192 الکترود EGNITE از ارائه شده است n = 3 آزمایش و 60 الکترود پلاتین از n = 1 آزمایش.

ضبط عصبی داخل قشری

کاشت داخل قشری

حیوانات با مخلوطی از کتامین/گزیلازین (75:1، 0.35 میلی‌لیتر/28 گرم داخل صفاقی) بیهوش شدند و این حالت با یک ماسک استنشاقی که 1.5 درصد ایزوفلوران را ارائه می‌کرد، حفظ شد. چندین میکرو اسکرو برای تثبیت ایمپلنت در جمجمه قرار داده شد و یکی از بالای مخچه به عنوان یک زمین عمومی استفاده شد. پروب در قشر جلوی مغز کاشته شد (مختصات: AP، 1.5 میلی متر؛ ML، 0.5 ± میلی متر؛ DV، 1.7- میلی متر از برگما). کاشت با پوشاندن پروب با مالتوز (به پروتکل زیر مراجعه کنید) انجام شد تا سفتی موقت پروب فراهم شود و قرار دادن پروب تسهیل شود. پروب با سیمان دندانی مهر و موم شد. اتصالات TDT-ZifClip برای اتصال پروب به سیستم الکتروفیزیولوژیکی از طریق یک کابل کوچک استفاده شد. پس از جراحی، موش تحت یک دوره نقاهت 1 هفته ای تحت درمان های ضد درد (بوپرنورفین) و ضد التهاب (ملوکسیکام) قرار گرفت. فعالیت عصبی با سیستم چند کاناله Open Ephys با نرخ نمونه‌برداری 30 کیلوهرتز با تقویت‌کننده Intan RHD2132 ثبت شد. آزمایش‌های تکلیف شنوایی در یک جعبه عایق صدا، با دو بلندگو در داخل با استفاده از پروتکل‌هایی بر اساس کار توصیف‌شده قبلی انجام شد.⁶¹. محرک صوتی شامل یک کلیک نویز سفید به طول 15 میلی‌ثانیه بود که 100 بار تکرار شد (چرخه)، که هر کدام با 5 اینچ (فاصله بین محرک) از هم جدا شدند. در حین انجام وظیفه، حیوان قادر به حرکت آزادانه بود.

پروتکل سفت کننده مالتوز

محلول آبی مالتوز تا نقطه انتقال شیشه ای گرم می شود.T_g)، بین 130 تا 160 درجه سانتیگراد، با استفاده از صفحه داغ یا مایکروویو. هنگامی که مالتوز چسبناک شد، قسمت پشتی پروب فقط با مالتوز در تماس است. همانطور که مالتوز سرد می شود، پروب را سفت و سفت می کند.

تحلیل داده ها

سیگنال های عصبی از هر الکترود برای استخراج SUA و LFP به صورت آفلاین فیلتر شدند. SUA با فیلتر کردن سیگنال بین 450 و 6,000 هرتز برآورد شد و اسپایک‌های نورون‌های جداگانه با استفاده از تجزیه و تحلیل مولفه اصلی با Offline Sorter v.4 (Plexon) مرتب شدند. برای به دست آوردن LFPها، سیگنال‌ها به 1 کیلوهرتز نمونه‌برداری شدند، روند حذف شدند و با فیلتر بریدگی برای حذف مصنوعات خط نویز (50 هرتز و هارمونیک‌های آن) با اسکریپت‌های سفارشی نوشته شده در پایتون. AEP SNR به عنوان نسبت دامنه پیک N1 و s.d محاسبه شد. یک دوره 20 میلی ثانیه قبل از محرک.

تحلیل آماری

داده های نشان داده شده در شکل. 3 ساعت، من میانگین هستند، n = 30 به عنوان تعداد آزمایشات متوسط. داده های ثبت شده از همان الکترود در روزهای 30، 60 و 90 نشان داده شده است. داده های یک حیوان ارائه شده است.

زیست سازگاری اپیکورتیکال مزمن

کاشت دستگاه های جراحی

در مجموع از 27 موش صحرایی نر بالغ نژاد Sprague-Dawley برای این مطالعه (ریور چارلز) استفاده شد. حیوانات در دمای محیطی 21± 2 درجه سانتی گراد و رطوبت 40-50 درصد در چرخه 12 اینچ نور/12 ساعت تاریکی قرار گرفتند. موش‌ها در گروه‌هایی قرار گرفتند و در طول دوره آزمایش به رژیم غذایی و آب دسترسی آزاد داده شدند. رویه‌های آزمایشی مطابق با قانون رفاه حیوانات (1998)، تحت تأیید وزارت کشور بریتانیا و سازمان محلی بررسی اخلاقی رفاه حیوانات (AWERB) انجام شد. حیوانات در طول مدت جراحی با ایزوفلوران (2 تا 3 درصد) بیهوش شدند و عمق بیهوشی با تست رفلکس انگشت پا کنترل شد. حیوانات در یک قاب استریوتاکسیک (Kopf، 900LS)، واقع در بالای یک پتوی حرارتی برای حفظ دمای بدن قرار گرفتند. سوراخ کرانیوتومی (~5 mm ×4 mm) با استفاده از مته دندانپزشکی با مته سوراخ 1 میلی‌متری با فاصله 0.9 میلی‌متری از خط وسط ساخته شد، سخت‌شکم برداشته شد و دستگاه اپیکورتیکال روی سطح قشر مغز قرار گرفت. سوراخ کرانیوتومی با Kwik-sil مهر و موم شد و سپس سیمان دندانی برای محکم شدن آن بسته شد و پوست بسته شد. تزریق زیر جلدی سالین (1 میلی‌لیتر به ازای هر کیلوگرم (وزن بدن)) و بوپرنورفین (0.03 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم (وزن بدن)) برای جایگزینی مایعات از دست رفته و کاهش درد پس از عمل انجام شد و بیهوشی متوقف شد.

جمع آوری و پردازش بافت

حیوانات در 2، 6 یا 12 هفته پس از لانه گزینی با روش مناسب برای نوع تجزیه و تحلیل خاتمه داده شدند.

بافت شناسی و ایمونوهیستوشیمی

در هفته های 2، 6 یا 12 پس از لانه گزینی، موش ها از طریق پرفیوژن قلبی با هپارینه (10 U ml) خاتمه یافتند.^-1، سیگما آلدریچ) PBS و به دنبال آن 4 درصد پارافورمالدئید (PFA، سیگما آلدریچ) در PBS. مغزها در 4% PFA به مدت 24 ساعت پس از تثبیت، سپس به ساکارز 30% در PBS برای حداقل 48 اینچ قبل از انجماد در ایزوپنتان منتقل شدند. سپس مغزها در دمای 80- درجه سانتیگراد ذخیره شدند تا در عمق 25 میکرومتر برودت شوند. سپس بافت برای مولکول آداپتور اتصال کلسیم یونیزه 1 (Iba-1) رنگ آمیزی شد تا سطح فعال شدن میکروگلیال تعیین شود. به طور خلاصه، مقاطع بافتی با 5٪ سرم بز در PBS با 0.1٪ Triton-X به مدت 1 ساعت قبل از انکوباسیون یک شبه در دمای 4 درجه سانتیگراد با آنتی بادی اولیه ضد Iba-1 مسدود شد (1:1,000، 019-19741؛ Wako). سپس برش ها با آنتی بادی ثانویه، ضد خرگوش الکسا فلور 594 (1:400، A-11012؛ Thermo Fisher) به مدت 1 اینچ در دمای اتاق رنگ آمیزی شدند. اسلایدها با روکش‌هایی با استفاده از رسانه‌های نصب ضد محو شدن Prolong Gold با 4,6،2-diamidino-3-phenylindole (ترمو فیشر) سوار شدند. کاوشگر منطقه ای به اندازه 3.7 × XNUMX میلی متر را پوشانده است² در سطح قشر مغز؛ مقاطع بافت انتخاب شده برای رنگ آمیزی 3.2 میلی متر طول این ناحیه را پوشش می دهند. اسلایدها با استفاده از اسکنر اسلاید میکروسکوپ 3DHistech Pannoramic-250 در 20× تصویربرداری شدند و تصاویر با استفاده از CaseViewer v.2.4 (3DHistech) آنالیز شدند. برای ارزیابی فعال‌سازی میکروگلیا، یک ناحیه 3.2 میلی‌متری پوشانده شد و هر 100 میکرومتر یک تصویر آنالیز شد. تصاویری با بزرگنمایی 8.5× گرفته شد که بخشی از محل کاوشگر اپیکورتیکال را در فاصله 3 میلی متری از خط وسط مغز، که منطقه را مستقیماً در زیر محل کاوشگر در بر می گیرد، جزئیات می دهد.

پردازش تصویر

داده‌های میکروسکوپی با استفاده از الگوریتمی برای توصیف فنوتیپ میکروگلیا پردازش شده‌اند (شکل تکمیلی). 13). فعال‌سازی میکروگلیال با استفاده از CellProfiler* سفارشی آنالیز شد (موسسه Broad, v.3.1.9 از https://cellprofiler.org/) خط لوله. ابتدا، ماژول EnhanceOrSuppressFeatures برای تقویت ساختارهای رشته ای مانند نوریت ها با استفاده از روش افزایش لوله استفاده شد. از تصاویر بهبودیافته، سلول ها با استفاده از ماژول IdentifyPrimaryObjects تقسیم شدند. اندازه‌گیری‌های اولیه سلول‌ها نشان می‌دهد که محدوده قطر مناسب جسم 3-40 پیکسل است. اشیاء خارج از این محدوده قطر یا لمس لبه تصویر کنار گذاشته شدند. سلول ها با استفاده از یک استراتژی آستانه تطبیقی دو کلاسه Otsu با اندازه پنجره تطبیقی 50 پیکسل تقسیم شدند. اشیاء شناسایی شده توسط ماژول IdentifyPrimaryObjects به ماژول MeasureObjectSizeShape برای محاسبه ویژگی های لازم برای طبقه بندی سلول ها وارد شدند. در ماژول ClassifyObjects، مقوله‌ای که بر اساس آن طبقه‌بندی می‌شود، AreaShape تعیین شد و Extent به عنوان اندازه‌گیری مربوطه انتخاب شد. سلول ها به عنوان طبقه بندی شدند 'activated» یا «non-activated» بر اساس خاصیت Extent آنها، که نسبت مساحت اشغال شده توسط سلول به مساحت اشغال شده توسط جعبه مرزی آن است. این رویکرد طبقه‌بندی با این واقعیت توجیه می‌شود که میکروگلیاهای فعال دارای بدنه‌های سلولی بزرگ و بدون فرآیند هستند و بنابراین نسبت به همتایان غیرفعال خود نسبت بیشتری از جعبه‌های مرزی خود را اشغال می‌کنند. در نهایت از ماژول های CalculateMath و ExportToSpreadsheet برای محاسبه و خروجی آمار مورد نظر استفاده شد.

تحلیل آماری

مجموعه داده ها هستند n = 3 برای هر نوع دستگاه (کاشت فقط PI (PI)؛ PI با طلای ریز ساخته شده در معرض (طلا)؛ و PI با طلای ریز ساخته شده و EGNITE (EGNITE) در تمام نقاط زمانی) به استثنای طلای 6 هفته ای که n = 2 برای داده های الایزا. نیمکره های طرف مقابل در هر نقطه زمانی برای دادن ترکیب شدند n = 9 در 2 و 12 هفته پس از لانه گزینی و n = 8 در 6 هفته پس از لانه گزینی. تجزیه و تحلیل داده ها با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism v.8 انجام شد. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از تجزیه و تحلیل واریانس دو طرفه (ANOVA) با آزمون مقایسه چندگانه توکی در صورت لزوم تکمیل شد. P < 0.05 معنی دار در نظر گرفته شد.

ELISA

پس از دوره لانه گزینی، حیوانات با دررفتگی دهانه رحم خاتمه یافتند. بافت مغز از هر دو نیمکره راست و چپ مغز استخراج شد، در نیتروژن مایع منجمد شد و تا استفاده بعدی در دمای -80 درجه سانتیگراد نگهداری شد. بافت با استفاده از بافر لیز NP-40 (150 میلی‌مولار NaCl، 50 میلی‌مولار Tris-Cl، 1 درصد جایگزین Nonidet P40، فلوکا، pH تنظیم‌شده روی 7.4) حاوی مهارکننده‌های پروتئاز و فسفاتاز (Halt Protease-Tailer, Phaphataseher و The Phosphaltase) لیز شد. به دنبال آن اختلال مکانیکی بافت (TissueLyser LT، Qiagen). سپس نمونه ها به مدت 10 دقیقه با سرعت 5,000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند و مایع رویی تا زمان استفاده بعدی در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد. پانل التهاب موش LEGENDplex (شماره کاتالوگ 740401، BioLegend)، یک کیت ELISA مولتی پلکس مبتنی بر مهره، برای تعیین کمیت سایتوکاین‌های زیر اجرا شد. IL-1α، IL-1β، IL-6، IL-10، IL-12p70، IL-17A، IL-18، IL-33، CXCL1 (KC)، CCL2 (MCP-1)، تحریک کننده کلنی گرانولوسیت-ماکروفاژ فاکتور، اینترفرون-γ و فاکتور نکروز تومور. کیت طبق دستورالعمل سازنده، با پروتئین بارگذاری شده در حجم ثابت 15 میکرولیتر اجرا شد. پس از انکوباسیون با مایع رویی، دانه‌ها روی فلوسیتومتر BD FACSVerse اجرا شدند و داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار تحلیل داده‌های LEGENDplex تجزیه و تحلیل شدند.

تحریک عصبی

کاشت داخل فاسیکولار

تمام آزمایشات حیوانی توسط کمیته اخلاقی دانشگاه Autònoma de Barcelona مطابق با دستورالعمل شورای جوامع اروپایی 2010/63/EU تأیید شد. حیوانات در دمای 22 ± 2 درجه سانتیگراد تحت چرخه 12 اینچ نور/12 اینچ تاریکی با غذا و آب آزادانه نگهداری شدند. عصب سیاتیک موشهای ماده بیهوش شده از نژاد Sprague-Dawley (250-300 گرم، ~18 هفتگی) تحت عمل جراحی قرار گرفت و الکترودهای TIME به صورت عرضی در سراسر عصب سیاتیک با کمک یک سوزن مستقیم متصل به یک نخ حلقه 10-0 کاشته شدند.⁴⁶. این فرآیند تحت یک میکروسکوپ تشریحی برای اطمینان از موقعیت صحیح مکان‌های فعال در داخل فاسیکل‌های عصبی مورد بررسی قرار گرفت (شکل 2). 4b). در طول آزمایش، دمای بدن حیوان با یک پد گرمایش حفظ شد.

تحریک عصبی با استفاده از قطارهای پالس های جریان دوفازی با مدت زمان ثابت 100 میکرو ثانیه در هر فاز و افزایش دامنه از 0 تا 150 میکروآمپر در گام های 1 یا 3 میکروآمپر در 3 اینچ هرتز برای 33 اینچ انجام شد (محرک NITE DS4 مختلف، میکروالکترودها به طور همزمان، CMAP ها از عضلات GM، TA و PL با استفاده از الکترودهای سوزنی کوچک (طول 13 میلی متر، قطر 0.4 میلی متر، الکترودهای سوزنی فولاد ضد زنگ A-03-14BEP، Bionic) که در هر عضله قرار داده شده بودند، ثبت شدند.⁶². الکترود فعال روی شکم عضله و مرجع در سطح تاندون قرار داده شد. ضبط های الکترومیوگرافی (100× برای GM و TA، × 1,000 برای PL؛ تقویت کننده های P511AC، Grass)، فیلتر باند گذر (3 اینچ هرتز تا 3 اینچ کیلوهرتز) و با یک سیستم ضبط PowerLab (PowerLab16SP, ADInstruments) دیجیتالی شدند.

تحلیل داده ها

دامنه هر CMAP از خط پایه تا حداکثر پیک منفی اندازه‌گیری شد. اندازه گیری پیک ولتاژ به حداکثر دامنه CMAP به دست آمده برای هر عضله در آزمایش نرمال شد. یک شاخص انتخاب (SI) برای هر مکان فعال به عنوان نسبت بین دامنه CMAP نرمال شده برای یک عضله، CMAP محاسبه شد._iو مجموع دامنه های نرمال شده CMAP در سه عضله، مطابق فرمول SI_i = nCMAP_i/∑nCMAP_jدر حداقل دامنه جریان تحریکی که حداقل پاسخ عضلانی مربوط به عملکرد را برانگیخت (به عنوان حداقل 5٪ دامنه CMAP برای یکی از عضلات با توجه به حداکثر دامنه CMAP آن عضله که قبلاً تعیین شده بود تعریف می شود). سپس، مکان‌های فعال با بالاترین SI برای هر یک از سه عضله به عنوان SI برای هر عضله در یک آزمایش مشخص انتخاب شدند.

زیست سازگاری درون عصبی مزمن

به دنبال روشی که قبلا گزارش شده است^50,63عصب سیاتیک موش‌های صحرایی ماده نژاد Sprague-Dawley بیهوش شده (250-300 گرم، ~18 هفته ای) در معرض دید قرار گرفت و دستگاه های سازگاری زیست محیطی با و بدون EGNITE به صورت طولی در شاخه تیبیال عصب سیاتیک کاشته شدند.n = 6-8 در هر گروه). به طور خلاصه، عصب در سه شاخه شدن با یک سوزن مستقیم متصل به یک نخ حلقه 10-0 (STC-6، Ethicon) سوراخ می شود. نخ نوک پیکانی نوار الکترود خم شده را می کشد. نوک آن برای از بین بردن نخ بریده شده و نوک هر بازو کمی خم شده است تا از بیرون کشیدن دستگاه جلوگیری شود. ایمپلنت طولی انتخاب شد زیرا امکان مطالعه بهتر پاسخ جسم خارجی در داخل عصب را فراهم می کند⁵⁰.

ارزیابی عملکرد اعصاب و حیوانات

حیوانات در طول پیگیری پس از لانه گزینی با استفاده از تست های هدایت عصبی، جذرسنجی و تست حرکت مسیر پیاده روی مورد ارزیابی قرار گرفتند.⁶². برای آزمایش‌های هدایت، عصب سیاتیک پنجه‌های کاشته‌شده و طرف مقابل توسط الکترودهای سوزنی در ناچ سیاتیک تحریک شد و CMAP عضله PL مانند بالا ثبت شد. تأخیر و دامنه CMAP اندازه گیری شد. برای تست جثه‌سنجی، موش‌ها روی یک سکوی شبکه سیمی قرار گرفتند و یک محرک مکانیکی غیر مضر با یک نوک فلزی متصل به یک جم‌سنج الکترونیکی فون فری (Bioseb) اعمال شد. آستانه درد (نیروی بر حسب گرم که حیوانات پنجه را بیرون کشیدند) پنجه های کاشته شده در مقابل طرف مقابل اندازه گیری شد. برای آزمایش مسیر پیاده روی، سطح کف پاهای پشتی با جوهر سیاه رنگ آمیزی شد و هر موش در امتداد یک راهرو رها شد. ردپاها جمع آوری شد و شاخص عملکردی سیاتیک محاسبه شد⁶².

بافت شناسی

پس از 2 یا 8 هفته، حیوانات با PFA (4٪) پرفیوژن شدند، و اعصاب سیاتیک برداشت، پس‌ثبت، انجماد و پردازش برای تجزیه و تحلیل بافت‌شناسی شدند. برای ارزیابی FBR، اعصاب سیاتیک در مقاطع عرضی به ضخامت 15 میکرومتر با کرایوستات (Leica CM190) بریده شدند. نمونه‌ها با آنتی‌بادی‌های اولیه برای آکسون‌های میلین دار (ضد RT97 برای برچسب‌گذاری Neurofilament 200K، 1:200؛ مطالعات توسعه بانک هیبریدوما) و ماکروفاژها (ضد Iba-1، 1:500؛ Wako) رنگ‌آمیزی شدند. سپس، بخش ها به مدت 1 ساعت در دمای اتاق با آنتی بادی های ثانویه الکسا فلور 488 ضد موش الاغ و الکسا فلور 555 ضد خرگوش الاغ (1:200، Invitrogen) انکوبه شدند. بخش‌های نماینده از قسمت مرکزی ایمپلنت در عصب تیبیا انتخاب شد، تصاویر با میکروسکوپ اپی فلورسانس (Eclipse Ni، Nikon) متصل به دوربین دیجیتال (DS-Ri2، Nikon) و تجزیه و تحلیل تصویر با نرم‌افزار ImageJ (موسسه ملی) گرفته شد. سلامت). مقدار سلول‌های Iba-1 مثبت در کل ناحیه عصب تیبیال اندازه‌گیری شد و ضخامت کپسول بافتی به عنوان میانگین فاصله هر طرف ایمپلنت تا نزدیک‌ترین آکسون اندازه‌گیری شد.

تحلیل آماری

برای تجزیه و تحلیل آماری داده ها از آنالیز واریانس یک یا دو طرفه و سپس آزمون تعقیبی Bonferroni برای تفاوت بین گروه ها یا زمان ها استفاده شد. برای نمایش و تحلیل گرافیکی از نرم افزار GraphPad Prism استفاده شد. زمانی که اهمیت آماری در نظر گرفته شد P <0.05