In vivo real-time positron emission partikel sporing (PEPT) og enkelt partikel PET – Nature Nanotechnology

Alle reagenser blev brugt som modtaget, medmindre andet er angivet. Alle kemikalier blev købt fra Sigma Aldrich undtagen tælleperlerne (CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen). ζ- Potentialet blev målt under anvendelse af en Zetasizer NanoZS90 (Malvern Instruments). Størrelsen og morfologien af ​​partiklerne blev undersøgt af SEM i et JEOL JSM 7800F Prime-mikroskop med integreret EDS for at give grundstofanalysen. Partikelstørrelsen blev bestemt ved at måle 50 uafhængige partikler. Radio øjeblikkelig tyndtlagskromatografi (ITLC) blev udviklet på Agilent Technologies glasmikrofiberkromatografipapir imprægneret med kiselsyre og analyseret ved hjælp af en Lablogic Flow-count TLC scanner og en BioScan B-FC-3200 fotomultiplikatorrør (PMT) detektor ved hjælp af Laura software. ITLC-mobilfasen var sammensat af 0.175 M citronsyre og 0.325 M trinatriumcitrat i vand, medmindre andet er angivet. Radioaktive prøver blev målt ved hjælp af en Capintec CRC-25R (Capintec) eller en LKB Wallac 1282 Compugamma CS (PerkinElmer), for hvilke data blev indsamlet ved hjælp af EdenTerm-software. Flowcytometri-eksperimenter blev udført i en BD FACSMelody-cellesorteringsindretning under anvendelse af BD FACSChorus Software. PET/CT-billeder blev erhvervet ved hjælp af en NanoPET/CT-scanner (Mediso), rekonstrueret ved hjælp af Nucline v.0.21-software, og billeder blev analyseret ved hjælp af VivoQuant-software (version 3.5, InviCRO). Listmode-data blev opnået af et specifikt MATLAB-softwareværktøj udviklet af Mediso. Autoradiografi blev udført i et GE Amersham Typhoon-instrument.

Syntese af silicapartikler af submikrometerstørrelse

Partiklerne blev syntetiseret ved hjælp af Stöber-metoden. Denne metode er baseret på hydrolyse og konsekutiv kondensation af siliciumalkoxider til fremstilling af monodisperse, sfæriske silicapartikler²⁷. Tetraethylorthosilicat (TEOS) blev brugt som siliciumkilde, ammoniak som basiskatalysator og kaliumchlorid som elektrolyt. En opløsning af TEOS i ethanol blev kontinuerligt tilsat til en opløsning indeholdende katalysatoren og elektrolytten. Ændring af reagensstartmængden eller tilsætningshastigheden giver forskelle i partikelstørrelsen som tidligere rapporteret²⁸. Her blev der fremstillet to opløsninger før syntesen af ​​partiklerne: Opløsning 1 indeholdende 19.0 mmol TEOS i 33.3 ml EtOH og Opløsning 2 indeholdende 0.23 mmol KCl i 9 ml ammoniak, 65 ml EtOH og 6.75 ml H₂O. Til syntesen blev opløsning 2 anbragt i en 250 ml rundbundet kolbe opvarmet til 50 °C under omrøring ved 300 rpm i 15 min. Derefter blev opløsning 1 tilsat dråbevis til opløsning 2 (tilførselshastighed 0.2 ml min^-1). Efter tilsætning af opløsning 1 blev de opnåede partikler oprenset ved centrifugering ved 18,300g i 3 minutter og vasket med EtOH fem gange. Endelig SiO₂ mikropartikler blev tørret under vakuum.

Podning af partikler i submikrometerstørrelse med silan-PEG_5k

En 20 mg ml^-1 opløsning af silan-PEG_5k (Sigma Aldrich) i EtOH 98% blev tilsat over en opløsning af smSiP ved 5 mg ml^-1 i EtOH 98% og 2.8% ammoniak. Blandingen blev omrørt natten over ved stuetemperatur, og partiklerne blev udvundet ved centrifugering ved 18,300°C.g i 3 min. Til sidst blev partiklerne vasket tre gange med destilleret vand og tørret under vakuum natten over. Vaskeopløsningerne blev frysetørret natten over og mængden af ​​ubundet silan-PEG_5k vægtet til beregning af reaktionsudbyttet. A 0.05 mg ml^-1 løsning af smSiP–PEG_5k i destilleret vand blev anvendt til yderligere radiomærkningsreaktioner.

[⁶⁸Ga]GaCl₃

Gallium-68 blev elueret som [⁶⁸Ga]GaCl₃ fra en Eckert og Ziegler ⁶⁸Ge /⁶⁸Ga-generator i ultraren HCl (4 ml, 0.1 M) fremstillet i henhold til krav til god fremstillingspraksis (ABX).

Koncentration af [⁶⁸Ga]GaCl₃ eluering ved kationbytning

Koncentrationen af ​​elueringen blev udført under anvendelse af opsætningen beskrevet i Supplerende Fig. 1. Først de 4 ml af [⁶⁸Ga]GaCl₃ eluering blev sat på en Strata-XC 33u patron (Phenomenex), og eluatet blev kasseret. Derefter blev patronen vasket med 5 ml af en acetone/0.1 M HCI (80:20) opløsning, og eluatet blev kasseret. Endelig koncentrerede [⁶⁸Ga]GaCl₃ blev opsamlet ved at tilsætte 700 µl af en acetone/0.05 M HCI (98:2) opløsning, tørret under en N₂ strøm og resuspenderet i 50 µl 0.5 M HEPES-buffer (pH 4.9). Radio-TLC blev udført på de forskellige stadier til kvalitetskontrol. Protokollen tager ca. 20 minutter og giver et genvindingsudbytte på 86.2 ± 8.5 %.

Radiomærkning af silicapartikler i forskellige koncentrationer med ⁶⁸Ga

Silicapartikler blev resuspenderet i forskellige koncentrationer (fra 1 til 0.002 mg ml^-1) i 0.5 M HEPES-buffer (pH 4.9). Derefter blev 50 µl af opløsningen tilsat i et reaktionsrør før tilsætning af det koncentrerede [⁶⁸Ga]GaCl₃ eluering i 50 µl 0.5 M HEPES-buffer (pH 4.9). Reaktioner blev udført ved 90 °C i 30 minutter, og radio-TLC blev udført for at beregne det radiokemiske udbytte.

Måling af partikelkoncentration ved flowcytometri

Partikelkoncentrationer blev beregnet ved flowcytometri under anvendelse af tælleperler (CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen) efter producentens instruktioner. Silicapartikler blev resuspenderet ved 0.05 mg ml^-110 µm afskæringsstørrelsesfilter (KX sprøjtefilter, nylon, 10 mm, 25 µm). CountBright Absolute Counting Beads blev opvarmet til stuetemperatur og vortexet i 10 sekunder. Derefter blev 30 µl perler tilsat til 50 µl silicapartikler, og blandingen blev hvirvlet i 300 minutter for at opnå en homogen opløsning. Prøven blev kørt på flowcytometeret, og tærsklen for fremadspredning (FSC) blev sat til at inkludere perlerne og partiklerne på lineær-FSC versus lineær sidespredningsplot. Bagefter blev fluorescensdetektorspændingen justeret for tælleperlerne, og en gatingstrategi blev udført for at isolere silicapartiklerne og tælleperlepopulationerne. Til sidst blev porte på partiklerne og de absolut tælleperler tegnet, og 30 perlebegivenheder blev registreret for hver prøve. Ved hjælp af denne strategi blev antallet af partikler i opløsning beregnet ved hjælp af følgende ligning:

Radiomærkning af 500 smSiP

Fem hundrede smSiP blev tilsat til 50 µl af den koncentrerede [⁶⁸Ga]GaCl₃ eluering i 0.5 M HEPES-buffer pH 4.9. Derefter blev 5.6 µl polysorbat 80 tilsat, og blandingen blev opvarmet til 90 °C i 30 minutter ved 900 rpm i en termisk blander. Bagefter blev en endelig flertrins oprensningsprotokol designet til at fjerne uomsat/kolloidalt ⁶⁸Ga. Halvtreds mikroliter 10 mM EDTA blev tilsat, og blandingen blev inkuberet i 5 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev partiklerne centrifugeret i 3 minutter ved 18,300g, resuspenderet i 500 µl PBS indeholdende 1 mM EDTA + 0.1 % polysorbat 80 og forsigtigt vortexet i 10 s. Partiklerne blev centrifugeret igen, vasket med en opløsning af 0.1 mM EDTA + 0.1 % polysorbat 80 i PBS og forsigtigt vortexet i 10 s. Til sidst blev partiklerne centrifugeret og vasket fem gange mere med PBS + 0.1 % polysorbat 80 og resuspenderet i 500 µl PBS. Radiomærkningsreaktionen blev overvåget ved radio-TLC under de successive reaktionstrin for at evaluere tilstedeværelsen af ​​kolloider (der kan forveksles med partikler, hvis de ikke fjernes korrekt), radiomærkningen af ​​partiklerne og renheden af ​​slutproduktet. RLY blev beregnet ved sammenligning mellem mængden af ​​radioaktivitet i partiklerne og supernatanterne efter vasketrinene.

Fraktionering

For fraktioneringsstrategien, volumener fra 0.5 µl til 20 µl af ⁶⁸Ga-smSiP ved en teoretisk koncentration på 1 partikel µl^-1 blev tilsat til forskellige prøverør i 1 µl trin (0.5, 1, 2, 3…), og PBS blev tilsat for at bringe det endelige volumen til 50 µl. Derefter blev 37.5 µl fra det første rør pipetteret i et andet prøverør, 25 µl af det andet rør i et tredje rør og til sidst 12.5 µl af det tredje rør til et fjerde rør. Denne strategi giver fire rør pr. prøve med et slutvolumen på 12.5 µl pr. rør. Radioaktiviteten i hvert rør blev målt i en gammatæller, og værdierne blev beregnet i kBq ved hjælp af en kalibreringskurve til yderligere sammenligning og analyse. Prøverne, der kun indeholdt det meste af radioaktiviteten i ét rør, blev sonikeret i 30 s ved stuetemperatur og underkastet et andet fraktioneringstrin. Derefter blev prøverne, hvori al radioaktivitet blev fundet i et enkelt rør (med ubetydelig aktivitet i de tre andre rør), brugt til yderligere in vivo/ex vivo eksperimenter.

PET/CT fantombilleddannelse

Et fantombilledeksperiment blev udført med en ⁶⁸Ga-smSiP. En kanyle blev brugt til at levere partiklen ind i et prøverør for at evaluere, om en enkelt partikel kunne forblive fanget i kanyleslangen under administration. Kort fortalt blev fantomrøret placeret i nanoPET/CT-scanneren med enden af ​​kanylespidsen fastgjort til røret. Efter start af PET-opsamlingen blev partiklen resuspenderet i 100 µl PBS leveret med en insulinsprøjte fastgjort til begyndelsen af ​​kanylen. Derefter blev kanylen vasket med 50 µl PBS for at sikre leveringen af ​​partiklen ind i fantomrøret. PET-opsamlingen blev udført i 2 timer efterfulgt af en standard CT-scanning.

In vivo PET/CT billeddannelse

Dyrebilleddannelsesundersøgelser blev etisk gennemgået og udført i overensstemmelse med Animals (Scientific Procedures) Act 1986 (ASPA) UK Home Office-bestemmelser, der regulerer dyreforsøg. In vivo billeddannelse blev udført i raske 8 uger gamle BALB/c mus. Dyr blev bedøvet med isofluran (2-3% i oxygen), kanyleret og anbragt på scannersengen under bedøvelse. Sengen blev opvarmet til 37 °C ved intern luftstrøm for at holde dyret ved normal kropstemperatur, og respirationshastigheden blev overvåget og holdt ved 60-80 åndedrag min.^-1 under hele scanningen. Det er vigtigt at opretholde kontrol over dyretemperaturen, da et uventet temperaturfald kan føre til en reduktion af partiklernes hastighed i blodet. En ⁶⁸Ga-smSiP (n = 4) eller ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k partikel (n = 2) blev administreret gennem kanylen i 100 µl PBS, efterfulgt af vask med 50 µl PBS efter start af PET-opsamlingen (1:5 koincidenstilstand; 5 ns koincidenstidsvindue). PET blev optaget i 2 timer, og derefter blev der udført en halvcirkelformet CT-scanning. Dyrenes kropstemperatur og respirationshastighed blev overvåget under hele processen. Dynamiske PET/CT-billeder blev rekonstrueret ved hjælp af Tera-Tomo 3D-rekonstruktion (400–600 keV energivindue, 1:5 koincidenstilstand, 20 iterationer og 1 undersæt) ved en voxelstørrelse på 0.4 × 0.4 × 0.4 mm³ og korrigeret for dæmpning, spredning og henfald. Listetilstandsdata for alle PET/PEPT-opkøb kan findes for ⁶⁸Ga-smSiP ved ref. ²⁹ og for ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k ved ref. ³⁰.

Sporing i realtid

Først blev data eksporteret fra scanneren i listetilstandsformat (det vil sige et format med et tidsstempel og krystalindeks for detekterede koincidensfotoner). En geometrisk transformation blev anvendt til at konvertere fra krystalindekser til position i mm-enheder. Birmingham-metoden beregner iterativt MDP fra en delmængde af alle LoR'erne. Det gør det ved at kassere LoR'er, der er længere end en fastsat afstand fra MDP'en, da disse sandsynligvis vil opstå fra falske LoR'er, for eksempel LoR'er, der kan stamme fra spredning. MDP raffineres med hver iteration; antallet af iterationer er effektivt indstillet af f-faktor og relaterer til det samlede antal LoR'er, der bruges til at estimere den endelige partikelposition inden for den delmængde (f.eks. en f-faktor på 0.5 betyder, at iterationssløjfen afsluttes, når 50 % af LoR'erne i delmængden er tilbage). Antallet af LoR'er, der bruges i en delmængde, kan reduceres for at forbedre den tidsmæssige sampling (delmængderne er tidskonsekutive uden overlap) på bekostning af at øge usikkerheden i positionen (yderligere detaljer om algoritmen kan findes i Parker et al.⁵) Birmingham-metoden blev brugt til at analysere listetilstandsdata fra PET-scanneren. En adaptiv prøvestørrelse blev brugt til at spore partiklen i musene. Prøvestørrelsen blev indstillet til at opnå en balance mellem tilstrækkelig tidsmæssig prøvetagning og samtidig minimere positioneringsfejl. En prøvestørrelse mellem 100 og 200 LoRs blev brugt i de tidlige stadier af scanningerne (<60 s fra scanningsstart), med f = 0.1, hvilket giver ca. 1-5 s intervaller. Ved scanningstider >60 s blev prøvestørrelserne varieret mellem 1,000 og 2,000, hvilket gav tidsintervaller på mellem 30 s og 60 s afhængigt af in vivo-eksperimentet. Antallet af tællinger, der bruges til at beregne MDP (i den endelige iteration) kan findes ved at gange stikprøvestørrelsen med f-faktorværdi. Disse parametre var baseret på tidligere erfaringer og informeret om tidligere publikationer¹.

Hastighed blev opnået som (sqrt{{v}_{x}^{2}+{v}_{y}^{2}+{v}_{z}^{2}}) hvor ({v}_{m}^{2}) er hastigheden i x, y , z retninger.

Ex vivo organoptagelse

Optagelse i forskellige organer blev evalueret ved gammatælling. Efter in vivo PET/CT-billeddannelse blev dyrene dræbt ved cervikal dislokation, og organer blev skåret ud og vejet til radioaktivitetstælling i en gammatæller (LKB Wallac 1282 Compugamma CS). Data blev udtrykt som procentdel injiceret dosis (dosis i organet/total dosis injiceret) pr. gram væv (%ID g^-1).

Autoradiografi

Radioaktiviteten i lungerne blev sporet med en strålingsdetektor (EP15 probe, Morgan), og lungerne blev skåret i små snit med en skalpel, indtil en lille del af vævet med det radioaktive signal blev opnået. Vævet blev lynfrosset i -80 °C isopropanol. Umiddelbart efter frysning blev vævet indlejret i medium med optimal skæretemperatur og skåret i en kryostat i 20 µm skiver. Hver skive blev undersøgt med detektoren, indtil den radioaktive skive blev fundet. Den forrige (under baggrund), radioaktive og næste (under baggrund) skive blev placeret på et Superfrost-mikroskopobjektglas (Epredia). Resten af ​​det resterende væv var også under baggrunden. Objektglasset med de tre sektioner blev dækket med husholdningsfilm og modsat en GE autoradiografiplade natten over. Pladen blev analyseret under anvendelse af GE Amersham Typhoon med 25 µm opløsning og PMT-indstilling på 4,000. Autoradiografibilledet blev overlejret på billedet af vævet, hvilket viste en plet af radioaktivitet i den radioaktive skive. Til kvantificeringen blev standarder fremstillet i forskellige kendte aktiviteter, og hver blev spottet som 1 µl kvintet i papir. Pletterne blev inkuberet i den samme opbevaringsphosphorskærm, BAS-IP MS (Multipurpose Standard) fra GE, som de enkelte partikler blev kvantificeret. Billedet blev erhvervet med Amersham Typhoon 5 med Control Software version 2.0 i fosfortilstand med en pixelstørrelse på 100 µm og en følsomhed på 4,000. Billederne blev kvantificeret med softwaren ImageQantTL v10.0-261 ved hjælp af gelkvantificeringsværktøjskassen. Pletterne blev korrigeret ved at vælge en region umiddelbart før eller efter pletten som en konstant baggrund. Det resulterende volumen af ​​pletten blev brugt til at beregne Bq i partiklen på basis af kalibreringskurven.

Statistik og reproducerbarhed

Til kvantitativ analyse blev mindst tre biologiske replikater analyseret, ekskl. in vivo data fra ⁶⁸Ga-smSiP–PEG_5k (n = 2). Data blev analyseret ved almindelig envejsvariansanalyse (ANOVA) med Dunnetts multiple sammenligningstest og Students t-prøve. EN P værdi <0.05 blev betragtet som statistisk signifikant.

• SEO Powered Content & PR Distribution. Bliv forstærket i dag.
• PlatoData.Network Vertical Generative Ai. Styrk dig selv. Adgang her.
• PlatoAiStream. Web3 intelligens. Viden forstærket. Adgang her.
• PlatoESG. Kulstof, CleanTech, Energi, Miljø, Solenergi, Affaldshåndtering. Adgang her.
• PlatoHealth. Bioteknologiske og kliniske forsøgs intelligens. Adgang her.
• Kilde: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01589-8