রেডিওনিউক্লাইড মূত্রাশয় ক্যান্সার থেরাপির জন্য ইউরেস-চালিত ন্যানোবট - প্রকৃতি ন্যানো প্রযুক্তি

প্লেটো দ্বারা প্রকাশিত

অনুসরণকারী: 0

ন্যানোবট সংশ্লেষণ

ন্যানোবটগুলি পূর্বে বর্ণিত হিসাবে প্রস্তুত করা হয়েছিল³³. সংক্ষেপে, MSNPs একটি পরিবর্তিত Stöber পদ্ধতি ব্যবহার করে সংশ্লেষিত হয়েছিল⁴¹, ট্রাইথানোলামাইন (35 g), অতি বিশুদ্ধ জল (20 ml) এবং hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB; 570 mg) 95 °C তাপমাত্রায় 30 মিনিট নাড়ার সময় বিক্রিয়া করে। টেট্রাইথাইল অর্থোসিলিকেট (1.5 ml) পরবর্তীতে ড্রপওয়াইজে যোগ করা হয়েছিল; মিশ্রণটিকে 2 ঘন্টার জন্য 95 °C তাপমাত্রায় বিক্রিয়া করার জন্য রেখে দেওয়া হয়েছিল এবং ফলস্বরূপ MSNPগুলি সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং ইথানলে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল (তিন বার, 2,500g, 5 মিনিট). CTAB টেমপ্লেটটি অপসারণ করার জন্য, MSNPগুলিকে 1.8 ঘন্টার জন্য অ্যাসিডিক মিথানল (30 ml HCl, 24 ml মিথানল) রিফ্লাক্সের অধীনে রাখা হয়েছিল। তারপরে, MSNPs সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং ইথানলে তিনবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল (2,500g, 5 মিনিট) MSNPs (6 mg ml) এ APTES (1 µl প্রতি MSNP) যোগ করে অ্যামাইন পরিবর্তন অন্তর্ভুক্ত করার আগে^-1) একটি 70% ইথানোলিক দ্রবণে 70 °C তাপমাত্রায়, 1 ঘন্টার জন্য জোরে জোরে নাড়তে থাকে। MSNPs-NH₂ সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে তিনবার ইথানলে এবং তিনবার জলে সংগ্রহ ও ধুয়ে ফেলা হয়েছিল (তিন বার, 1,150g, 5 মিনিট). MSNPs-NH₂ 1 mg ml এর ঘনত্বে PBS-এ পুনরায় স্থগিত করা হয়েছিল^-1 এবং মোট আয়তন 900 µl, এবং গ্লুটারালডিহাইড (100 µl) দিয়ে ঘরের তাপমাত্রায় 2.5 ঘন্টার জন্য সক্রিয় করা হয়। সক্রিয় MSNPs-NH₂ সেন্ট্রিফিউগেশন (1,150g, 5 মিনিট), urease (3 mg ml) এর দ্রবণে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়^-1) এবং heterobifunctional PEG (1 μg PEG প্রতি mg 5 kDa HS-MSNPs-NH₂) পিবিএস-এ, এবং ঘরের তাপমাত্রায় 24 ঘন্টার জন্য প্রতিক্রিয়া দেখায়। ফলস্বরূপ ন্যানোবটগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে পিবিএস-এ তিনবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল (1,150g, 5 মিনিট) এউএনপিগুলির বিচ্ছুরণে তাদের পুনরায় স্থগিত করার আগে, পূর্বে বর্ণিত হিসাবে প্রস্তুত⁵¹, সেগুলিকে 10 মিনিটের জন্য প্রতিক্রিয়াশীল রেখে, এবং সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে ধুয়ে ফেলুন (তিন বার, 1,150g, 5 মিনিট).

MSNPs, MSNPs-NH এর হাইড্রোডাইনামিক আকারের বন্টন এবং পৃষ্ঠের চার্জ₂, ন্যানোবট এবং এউএনপি-সজ্জিত ন্যানোবটগুলি যথাক্রমে একটি Wyatt Mobius ডাইনামিক লাইট স্ক্যাটারিং সিস্টেম এবং একটি Malvern Zetasizer ব্যবহার করে নির্ধারিত হয়েছিল। সমস্ত ক্ষেত্রে, ঘনত্ব ছিল 20 µg ml^-1 এবং অধিগ্রহণের সময় 5 s, প্রতি পরীক্ষায় তিনটি রান ব্যবহার করে। প্রতি কণার ধরণে তিনটি পরিমাপ করা হয়েছিল।

FITC MSNPs এর সংশ্লেষণ

FITC (2 mg), ইথানল (5 ml) এবং APTES (400 µl) এর মিশ্রণ প্রস্তুত করা হয়েছিল এবং 30 মিনিটের জন্য নাড়াচাড়া করা হয়েছিল। তারপরে, MSNP সংশ্লেষণের জন্য পূর্বে বর্ণিত প্রোটোকল অনুসরণ করা হয়েছিল, আমরা FITC-APTES মিশ্রণ (1.25 µl) এর সাথে সংমিশ্রণে টেট্রাইথাইল অর্থোসিলিকেট (250 ml) ড্রপওয়াইজে যোগ করেছি। FITC-লেবেলযুক্ত ন্যানোবটগুলি পাওয়ার জন্য কার্যকরীকরণের পদক্ষেপগুলি পূর্বোক্ত হিসাবে ছিল।

AuNPs এর সংশ্লেষণ

এউএনপিগুলি একটি রিপোর্ট করা পদ্ধতি ব্যবহার করে সংশ্লেষিত হয়েছিল³³. সংক্ষেপে, সমস্ত উপকরণ সদ্য প্রস্তুত অ্যাকোয়া রেজিয়া ব্যবহার করে পরিষ্কার করা হয়েছিল, জল দিয়ে পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে ধুয়ে এবং বাতাসে শুকানো হয়েছিল। পরবর্তীকালে, একটি 1 mM AuCl₄ একটি রিফ্লাক্স সিস্টেমে সমন্বিত একটি গোলাকার নীচের ফ্লাস্কে নাড়ার সময় দ্রবণটি তার স্ফুটনাঙ্কে উত্তপ্ত হয়েছিল। এর পরে, 10 মিলি সোডিয়াম সাইট্রেট দ্রবণ (30.8 mM) যোগ করা হয়েছিল, এবং দ্রবণটি 20 মিনিটের জন্য সিদ্ধ করা হয়েছিল, যার ফলে একটি লাল রঙ হয়। তারপর দ্রবণটি 1 ঘন্টার জন্য নাড়ার সময় ঘরের তাপমাত্রায় ঠান্ডা হতে দেওয়া হয়েছিল। ফলস্বরূপ এউএনপিগুলি অন্ধকারে সংরক্ষণ করা হয়েছিল এবং ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ব্যবহার করে চরিত্রায়ন করা হয়েছিল।

এনজাইমের কার্যকলাপ

ন্যানোবটের এনজাইমেটিক কার্যকলাপ, ¹⁸এফ-ন্যানোবট এবং ¹³¹আই-ন্যানোবটগুলি ফিনল লাল ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। এটি করতে, 2 µl ন্যানোবট (1 mg ml^-1) একটি 96-ওয়েল প্লেটে যোগ করা হয়েছিল এবং 200 µl বিভিন্ন ইউরিয়া দ্রবণে (0, 50, 100, 200 mM) 1.1 mM ফেনল রেডের সাথে মিশ্রিত করা হয়েছিল। 560 nm-এ শোষণ সময়ের সাথে 37 °C এ পরিমাপ করা হয়েছিল।

অপটিক্যাল মাইক্রোস্কোপির মাধ্যমে ন্যানোবট গতির গতিবিদ্যা

ন্যানোবটগুলির অপটিক্যাল ভিডিওগুলি একটি লাইকা থান্ডার মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে অর্জিত হয়েছিল, একটি হামামাত্সু উচ্চ-গতির সিসিডি ক্যামেরা এবং একটি ×1.25 উদ্দেশ্য সহ। এর জন্য, ন্যানোবটগুলিকে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং পিবিএসের 50 µl (20 mg ml-এর চূড়ান্ত ঘনত্ব) তে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল^-1) তারপরে, একটি পেট্রি ডিশ 3 ml PBS বা ইউরিয়ার 300 mM দ্রবণ (PBS-এ) দিয়ে ভরা হয়েছিল এবং মাইক্রোস্কোপের নীচে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। ন্যানোবট সহ একটি 5 µl ড্রপ (20 mg ml^-1) তারপর তরল-ভরা পেট্রি ডিশে যোগ করা হয়েছিল এবং প্রতি সেকেন্ডে 25 ফ্রেমে ভিডিও রেকর্ড করা হয়েছিল। ইমেজজে সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে ROI তে ভিডিও পিক্সেল তীব্রতা বিতরণ 15 s বিরতিতে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

ন্যানোবটের রেডিওলেবেলিং এর সাথে [¹⁸F]F-PyTFP

সংশ্লেষণ [¹⁸F]F-PyTFP

[¹⁸F]F-PyTFP পূর্বে রিপোর্ট করা পদ্ধতি অনুসরণ করে নেপটিস xSeed মডিউলে (অপ্টিমাইজড রেডিওকেমিক্যাল অ্যাপ্লিকেশন) সংশ্লেষিত হয়েছিল³³.

সংশ্লেষ ¹⁸F-লেবেলযুক্ত ন্যানোবট

ন্যানোবটগুলিকে লেবেল করা হয়েছিল [¹⁸F]F-PyTFP, সামান্য পরিবর্তন সহ পূর্বে প্রতিষ্ঠিত পদ্ধতির ভিত্তিতে³³. সংক্ষেপে, 200 µl ন্যানোবট দ্রবণ (1 mg ml^-1) সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল (10 মিনিট, 13,853g), PBS এর 10 µl (1 mM, pH 8) তে পুনরায় স্থগিত করা হয়েছে এবং [এর 4 µl দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছে¹⁸F]F-PyTFP ঘরের তাপমাত্রায় 37 মিনিটের জন্য অ্যাসিটোনিট্রিলে (প্রায় 35 MBq)। ইনকিউবেশনের পরে, প্রতিক্রিয়া মিশ্রণটি জল (200 µl) দিয়ে মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং সেন্ট্রিফিউগেশন (5 min, 13,853) দ্বারা বিশুদ্ধ করা হয়েছিলg) ডোজ ক্যালিব্রেটরে (CPCRC-25R, Capintec) পরিমাপ করার আগে ফলস্বরূপ পেলেটটি তিনবার জল দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। ধোয়ার পরে ন্যানোবটগুলিতে উপস্থিত তেজস্ক্রিয়তার পরিমাণ এবং তেজস্ক্রিয়তার প্রাথমিক পরিমাণের মধ্যে অনুপাত হিসাবে রেডিওকেমিক্যাল ফলন গণনা করা হয়েছিল। বিশুদ্ধকরণের পরে রেডিও-রাসায়নিক বিশুদ্ধতা ছিল ≥99%, যথাক্রমে স্থির এবং মোবাইল পর্যায় হিসাবে iTLC-SG ক্রোমাটোগ্রাফি পেপার (এজিলেন্ট টেকনোলজিস) এবং ডাইক্লোরোমেথেন এবং মিথানল (2:1) ব্যবহার করে রেডিও থিন-লেয়ার ক্রোমাটোগ্রাফি (রেডিও-টিএলসি) দ্বারা নির্ধারিত। টিএলসি প্লেটগুলি একটি টিএলসি রিডার (মিনিজিটিএ, রেটেস্ট) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

এর স্থায়িত্ব ¹⁸এফ-ন্যানোবট

এর স্থায়িত্ব ¹⁸F-লেবেলযুক্ত ন্যানোবটগুলি নিম্নলিখিত মিডিয়া ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল: (1) 300 mM ইউরিয়া, (2) জল এবং (3) টিউমার বহনকারী প্রাণীর প্রস্রাব। ¹⁸এফ-লেবেলযুক্ত ন্যানোবট (10 µl) ঘরের তাপমাত্রায় 100 ঘন্টার জন্য সংশ্লিষ্ট দ্রবণ (1 µl) দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। তারপরে, ন্যানোবট এবং সুপারনাট্যান্টকে সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা আলাদা করা হয়েছিল এবং সংগ্রহ করা হয়েছিল, এবং তেজস্ক্রিয়তা একটি ডোজ ক্যালিব্রেটরে (CPCRC-25R) পরিমাপ করা হয়েছিল।

সঙ্গে ন্যানোবট এর রেডিওলেবেলিং ¹³¹I

ইউরিস ন্যানোবটগুলির রেডিও আয়োডিনেশন ইনজেকশনের সাথে ন্যানোবটগুলিকে ইনকিউব করে সঞ্চালিত হয়েছিল [¹³¹I]NaI সমাধান (925 MBq ml^-1; জিই হেলথ কেয়ার)। সংক্ষেপে, 400 µl urease ন্যানোবট দ্রবণ (1 mg ml^-1) সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল (13,853g, 5 মিনিট), PBS এর 100 µl (10 mM, pH 7.4) এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছে এবং 25 µl বা 185 µl ইনজেকশনযোগ্য [¹³¹I]NaI (যথাক্রমে প্রায় 42.55 বা 277.5 MBq) 30 মিনিটের জন্য, পছন্দসই চূড়ান্ত কার্যকলাপের উপর নির্ভর করে। ইনকিউবেশনের পরে, প্রতিক্রিয়া মিশ্রণটি সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা শুদ্ধ করা হয়েছিল (13,853g, 5 মিনিট). ফলস্বরূপ অবক্ষেপ জল (100 µl) দিয়ে তিনবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। একটি ডোজ ক্যালিব্রেটর (CPCRC-25R) ব্যবহার করে সুপারনাট্যান্ট এবং অবক্ষেপণের তেজস্ক্রিয়তা নির্ধারণ করা হয়েছিল, এবং উভয় ভগ্নাংশই রেডিও-টিএলসি দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ¹⁸এফ-ন্যানোবট।

পশু মডেল উন্নয়ন

ইউরোপীয় কাউন্সিল নির্দেশিকা 2010/63/UE এবং অভ্যন্তরীণ নির্দেশিকা অনুসারে ইঁদুরগুলি রক্ষণাবেক্ষণ এবং পরিচালনা করা হয়েছিল। সমস্ত পরীক্ষামূলক পদ্ধতি CIC biomaGUNE নীতিশাস্ত্র কমিটি এবং স্থানীয় কর্তৃপক্ষ (Diputación Foral de Guipuzcoa, PRO-AE-SS-276) দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল। চিত্র বিশ্লেষণ (পিইটি এবং এমআরআই উভয়ই) প্রাণীদের গ্রুপ বিতরণের দিকে অন্ধ ছিল।

মূত্রাশয় ক্যান্সারের অর্থোটোপিক মিউরিন মডেলটি MB49 কোষের (মুরিন কার্সিনোমা মূত্রাশয় কোষ লাইন) C57BL/6JRj মহিলা ইঁদুর (8 সপ্তাহ বয়সী, জানভিয়ার) এর ইন্ট্রাভেসিকাল প্রশাসন দ্বারা উত্পন্ন হয়েছিল। টিউমার জমাকরণ (চারটি গ্রুপ; নীচের বিবরণ) নির্ধারণের লক্ষ্যে পরীক্ষাগুলির জন্য, নিম্নলিখিত অনুমান সহ নির্ভুলতা বিশ্লেষণ ব্যবহার করে নির্ধারিত হিসাবে প্রতি গ্রুপে ছয়টি প্রাণীকে টিকা দেওয়া হয়েছিল: প্রয়োজনীয় নির্ভুলতা, 20%; প্রত্যাশিত s.d., ±20%; আত্মবিশ্বাস, 95%; পশু ক্ষতি, 20%। থেরাপিউটিক কার্যকারিতা পরীক্ষাগুলির জন্য (ছয়টি গ্রুপ; নীচে বিশদ বিবরণ), প্রতি গোষ্ঠীতে দশটি প্রাণী অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল, যেমন একটি এক-লেজযুক্ত ছাত্র ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল t-পরীক্ষা, নিম্নলিখিত অনুমান সহ দুটি স্বাধীন উপায়ের মধ্যে পার্থক্য: শূন্য অনুমান, চিকিত্সা টিউমার বৃদ্ধিকে প্রভাবিত করে না; α, 0.05; 1 - β, 0.95; s.d., ±50%; গ্রুপের মধ্যে প্রত্যাশিত পার্থক্য, 50%; পশু ক্ষতি, 20%। যেহেতু পরীক্ষাটি অপারেশনাল কারণে দুটি ব্যাচে পরিচালিত হয়েছিল, একটি নিয়ন্ত্রণ গ্রুপ উভয় ব্যাচে অন্তর্ভুক্ত ছিল (সারণী 2), এবং তারপর সমস্ত প্রাণী পুল করা হয়েছিল। টিউমার স্থাপনের জন্য, বিশুদ্ধ O-তে 3% আইসোফ্লুরেন ইনহেলেশনের মাধ্যমে ইঁদুরকে চেতনানাশক করা হয়েছিল।₂ এবং 1.0% O-তে 1.5-100% আইসোফ্লুরেন দ্বারা রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়₂. তারপরে, মূত্রাশয়টি খালি করা হয়েছিল, এবং 50 µl পলি-এর ইন্ট্রাভেসিস ইনস্টিল করার মাধ্যমে ইউরোথেলিয়ামে রাসায়নিক ক্ষত সৃষ্টি হয়েছিল।l24 মিনিটের জন্য 15-গেজ ক্যাথেটারের মাধ্যমে লাইসিন (সিগমা-অলড্রিচ)। পরবর্তীকালে, মূত্রাশয়টি আবার খালি করা হয়েছিল এবং MB49 কোষগুলি (10⁵ কোষ) উচ্চ-গ্লুকোজ ডিএমইএম (100 µl) এ ক্যাথেটার অপসারণ করার আগে এবং পেটের ম্যাসেজের মাধ্যমে মূত্রাশয় খালি করার আগে 1 ঘন্টার জন্য ইনস্টিল করা হয়েছিল। পরীক্ষার সময়, স্বাস্থ্য ও কল্যাণ পর্যবেক্ষণের জন্য ইঁদুরগুলি পর্যবেক্ষণ এবং ওজন করা হয়েছিল। ওজন হ্রাস 20% ছাড়িয়ে গেলে বা ক্লিনিকাল লক্ষণগুলির ভিত্তিতে, দায়িত্বে থাকা পশুচিকিত্সকের মানদণ্ডের অধীনে একটি মানব শেষ পয়েন্ট প্রয়োগ করা হয়েছিল।

টিউমার আকার ট্র্যাকিং

7 mT m এর BGA-14S গ্রেডিয়েন্ট ইনসার্ট দিয়ে সজ্জিত 7 T Bruker BioSpec USR 70/30 স্ক্যানার (Bruker BioSpin) ব্যবহার করে টিউমার ইনডাকশনের 12 এবং 440 দিন পরে MRI স্টাডি করা হয়েছিল।^-1 এবং রেডিও ফ্রিকোয়েন্সির জন্য একটি 112/086 QSN রেজোনেটর (T12053V3)¹⁴ ট্রান্সমিশন, এবং RF রিসেপশনের জন্য একটি ইঁদুরের ব্রেন সারফেস কয়েল (T11205V3) (উভয়ই 300 MHz এ কাজ করে)। প্রাণীকে আইসোফ্লুরেন দিয়ে চেতনানাশক করা হয়েছিল (আবেশের জন্য 4% এবং 1.5% O-তে রক্ষণাবেক্ষণের জন্য 50%)₂/50% N₂ মিশ্রণ) এবং একটি এমআর-সামঞ্জস্যপূর্ণ দোলনায় রাখা। শরীরের তাপমাত্রা এবং শ্বাস-প্রশ্বাসের হার একটি এমআর-সামঞ্জস্যপূর্ণ মনিটরিং ডিভাইস (মডেল 1030 SA, ছোট প্রাণীর যন্ত্র) ব্যবহার করে ক্রমাগত নিরীক্ষণ করা হয়েছিল, শরীরের তাপমাত্রা বজায় রাখার জন্য একটি ছোট-ইঁদুর এয়ার হিটার সিস্টেমের সাথে ইন্টারফেস করা হয়েছিল। রেফারেন্স ইমেজ অর্জনের পর, একটি স্পিন-ইকো-ভিত্তিক ডিফিউশন-ওয়েটেড ইমেজিং সিকোয়েন্স ব্যবহার করা হয়েছিল টিউমারগুলিকে ইমেজ করার জন্য, নিম্নলিখিত প্যারামিটারগুলি ব্যবহার করে: ইকো টাইম (T_E) = 22.3 ms, পুনরাবৃত্তির সময় (T_R) = 2,500 ms, n = 2 গড়, একটি A0 চিত্র (এর সাথে বেসাল চিত্র b = 0 s মিমি^-2) এবং একটি DW চিত্র একটি গ্রেডিয়েন্ট সময়কাল সহ (1, 0, 0) দিকে ডিফিউশন গ্রেডিয়েন্ট ব্যবহার করে অর্জিত δ = 4.5 ms এবং একটি গ্রেডিয়েন্ট সেপারেশন Δ = 10.6 ms, দেওয়া b = 650 s মিমি^-2, একটি 16 × 16 মিমি² দর্শনের ক্ষেত্র, 160 × 160 পয়েন্টের চিত্র ম্যাট্রিক্স আকার, 20 মিমি পুরুত্বের 0.5টি পরপর স্লাইস (কোনও ফাঁক নেই, ইন্টারলিভড মোডে অর্জিত) এবং প্রতি পিক্সেল 192.9 Hz ব্যান্ডউইথ৷ টিউমারগুলি কল্পনা করার জন্য, চিত্রগুলিকে ইমেজজে সফ্টওয়্যার দিয়ে পোস্টপ্রসেস করা হয়েছিল, একটি ডিফিউশন গ্রেডিয়েন্টের সাথে অর্জিত ছবিগুলিকে ভাগ করে (b = 650 s মিমি^-2) ছাড়া অর্জিত দ্বারা (b = 0 s মিমি^-2), এবং একটি 3D গাউসিয়ান ফিল্টার প্রয়োগ করা (σ_x = σ_y = σ_z = 0.7) ফলাফলে। টিউমারগুলি তাদের আয়তন নির্ধারণের জন্য ম্যানুয়ালি চিত্রিত করা হয়েছিল।

ভিভো বায়োডিস্ট্রিবিউশনে

টিউমার ইনডাকশনের 15 তম দিনে, গ্রুপগুলির মধ্যে সমজাতীয় গড় টিউমার ভলিউম বিতরণ পেতে ইঁদুরগুলিকে চারটি গ্রুপে এলোমেলো করা হয়েছিল। PET-CT স্ক্যানগুলি (MOLECUBES β এবং X-CUBE স্ক্যানার) 3 µl ইন্ট্রাভেসিকভাবে পরিচালনা করার পরে 100 ঘন্টা অর্জিত হয়েছিল ¹⁸F-BSA (গ্রুপ 1 এবং 2) বা ¹⁸F-urease (গ্রুপ 3 এবং 4) 200 µg ml ঘনত্বে ন্যানোবট^-1, যানবাহন হিসাবে জল (গ্রুপ 1 এবং 3) বা জলে 300 মিমি ইউরিয়া (গ্রুপ 2 এবং 4) ব্যবহার করে (সারণী 1) ইমেজ অধিগ্রহণের জন্য, প্রাণীদের এনেস্থেশিয়া (বিশুদ্ধ অক্সিজেনে 5% আইসোফ্লুরেন) দিয়ে প্ররোচিত করা হয়েছিল এবং মূত্রাশয় খালি করার জন্য পেটের অঞ্চলে ম্যাসেজ করার আগে একটি সুপাইন অবস্থানে রাখা হয়েছিল। এর পরপরই সংশ্লিষ্ট ¹⁸F-লেবেলযুক্ত ন্যানোবট (¹⁸F-BSA/¹⁸পানি/ইউরিয়াতে এফ-ইউরিয়া) একটি 24-গেজ ক্যাথেটারের মাধ্যমে মূত্রাশয়ে প্রবেশ করানো হয় এবং ক্যাথেটারটি অপসারণের আগে, মূত্রাশয় খালি করে এবং ইঁদুরকে অ্যানেশেসিয়া থেকে পুনরুদ্ধার করার আগে 1 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়। এ t = 3 ঘন্টা প্রশাসনের পরে, প্রাণীদের পুনরায় চেতনানাশক করা হয়েছিল এবং 10 মিনিট স্থির পুরো শরীরের PET চিত্রগুলি অর্জিত হয়েছিল, তারপরে সিটি স্ক্যান করা হয়েছিল৷ র্যান্ডম, স্ক্যাটার এবং অ্যাটেন্যুয়েশন সংশোধন সহ 3D অর্ডার করা সাবসেট এক্সপেকটেশন ম্যাক্সিমাইজেশন পুনর্গঠন অ্যালগরিদম ব্যবহার করে PET চিত্রগুলি পুনর্গঠন করা হয়েছিল। একই মাউসের PET-CT চিত্রগুলি PMOD চিত্র প্রক্রিয়াকরণ সরঞ্জাম ব্যবহার করে সহ-নিবন্ধিত এবং বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। একটি 3D কনট্যুর টুল ব্যবহার করে উপরের মূত্রাশয় অঞ্চলে আগ্রহের পরিমাণ তৈরি করে এবং প্রতি অঙ্গ প্রতি কিলোবেক্যুরেলে ক্রিয়াকলাপ (ক্ষয় সংশোধন) পরিমাপ করে তেজস্ক্রিয়তা বনাম সময়ের ঘনত্বের প্লটগুলি পাওয়া যায়। একটি ক্রমাঙ্কন ফ্যাক্টর প্রয়োগ করে ফলাফলগুলি সংশোধন করা হয়েছিল এবং তারপর এমআরআই-প্রাপ্ত টিউমার ভলিউম দ্বারা স্বাভাবিক করা হয়েছিল।

প্রাক্তন ভিভো অধ্যয়ন

হিস্টোপ্যাথোলজিক বিশ্লেষণ

সমস্ত ইমেজিং সম্পন্ন করার পরে, নির্বাচিত মূত্রাশয় (n টিউমার বহনকারী এবং সুস্থ প্রাণী থেকে প্রতি গ্রুপে = 3টি অ্যাসেপটিক অবস্থায় সরানো হয়েছিল এবং অবিলম্বে 4% ফর্মালডিহাইডে স্থির করা হয়েছিল। তারপরে, হেমাটক্সিলিন-ইওসিন স্টেনিংয়ের জন্য 2-3 µm বিভাগ নেওয়ার আগে মূত্রাশয়গুলি প্যারাফিনে এম্বেড করা হয়েছিল। হিস্টোপ্যাথলজিক পরীক্ষার জন্য সমস্ত শর্ত থেকে প্রতিনিধি চিত্রগুলি প্রাপ্ত হয়েছিল।

আইসিপি-এমএস বিশ্লেষণ

পরিমাপগুলি একটি থার্মো iCAP Q ICP-MS (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) এবং একটি ASX-560 অটোস্যাম্পলার (CETAC টেক) এর সাথে সঞ্চালিত হয়েছিল। সমস্ত ইমেজিং শেষ করার পরে, প্রাণীদের হত্যা করা হয়েছিল এবং মূত্রাশয়গুলিকে বেছে নেওয়া হয়েছিল (n গ্রুপ প্রতি = 2; চারটি গ্রুপ) HNO এর 1 ml-এ সংগ্রহ এবং হজম করা হয়₃:HCl (4:1 মিশ্রণ)। অঙ্গগুলি সম্পূর্ণরূপে দ্রবীভূত না হওয়া পর্যন্ত বিচ্ছুরণটি সিদ্ধ করা হয়েছিল। তারপরে, সমাধানটি ঘরের তাপমাত্রায় ঠান্ডা করা হয়েছিল এবং প্রতিটি নমুনায় Au এর ঘনত্ব নির্ধারণ করতে ICP-MS ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, ফলাফলগুলিকে প্রতি গ্রাম টিস্যুতে ইনজেকশনের ডোজ শতাংশে রূপান্তরিত করে (%ID g^-1).

ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি এবং কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি ইমেজিং

ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি বিশ্লেষণের জন্য, টিউমার বহনকারী প্রাণীরা পানিতে FITC-লেবেলযুক্ত ন্যানোবট বা 300 mM ইউরিয়া (n পিইটি-সিটি অধ্যয়নের জন্য উপরে বর্ণিত হিসাবে = 4 প্রতি গোষ্ঠী। উপরন্তু, ন্যানোবট ছাড়া টিউমার বহনকারী প্রাণী একটি নিয়ন্ত্রণ গ্রুপ হিসাবে কাজ করে (n = 2)। সব ক্ষেত্রে, মূত্রাশয় সংগ্রহ করা হয়, হিমায়িত করা হয় এবং 10 µm অংশে কাটা হয় যা অবিলম্বে 10% ফর্মালডিহাইডে 15 মিনিটের জন্য স্থির করা হয়, 10 mM PBS দিয়ে ধুয়ে তারপর 50 mM NH এ ইনকিউব করা হয়।₄PBS দিয়ে আবার ধুয়ে ফেলার আগে 5 মিনিটের জন্য PBS-এ Cl করুন। ঘরের তাপমাত্রায় 1 মিনিটের জন্য মিথানল: অ্যাসিটোন (1:5) এবং 0.1 মিনিটের জন্য PBS-এ 5% ট্রাইটন দিয়ে পারমিবিলাইজেশন করা হয়েছিল। পিবিএস ধোয়ার পর, নমুনাগুলি পিবিএস-এ 5% BSA–0.5% টুইনের দ্রবণে 15 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় স্যাচুরেট করা হয়েছিল এবং 1% BSA-তে মাউস অ্যান্টি-FITC (1:100, Abcam) দিয়ে ঘরের তাপমাত্রায় 5 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। -0.5% টুইন। বিভাগগুলি 10 মিমি পিবিএস দিয়ে 5 মিনিটের জন্য তিনবার ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল এবং 30% TSA-ween-এ সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি অ্যালেক্স ফ্লুর 647 গাধা অ্যান্টি-মাউস আইজিজি (আণবিক অনুসন্ধান, লাইফ টেকনোলজিস, 1:1,000) দিয়ে ঘরের তাপমাত্রায় 5 মিনিটের জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। পিবিএস-এ, আবার পিবিএস (0.5 × 3 মিনিট) এ ধুয়ে এবং 5-ডায়ামিডিনো-4,6-ফেনিলিন্ডোল (DAPI; মলিকুলার প্রোবস, লাইফ টেকনোলজি) সহ একটি প্রোলং অ্যান্টিফেড কিট দিয়ে মাউন্ট করা হয়েছে। সমস্ত বিভাগের জন্য অভিন্ন সেটিংস সহ একটি Leica STELLARIS 2 কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ (UPV/EHU সায়েন্টিফিক পার্ক) দিয়ে চিত্রগুলি অর্জিত হয়েছিল: টাইল ইমেজিং এবং সেলাইয়ের সাথে ×5 বিবর্ধন (সাধারণত 10 × 4 দৃশ্যের ক্ষেত্র)। লেজার লাইন এবং সনাক্তকরণ উইন্ডোগুলি DAPI-এর জন্য 5 nm এবং 405–440 nm, FITC সাদা লেজারের জন্য 503 nm এবং 489–494 nm এবং la Alexa602 এর জন্য 653 nm এবং 660–836 nm।

অপটিক্যাল ক্লিয়ারিং

4% প্যারাফর্মালডিহাইড এবং পিবিএস দিয়ে পারফিউশনের পরে, মূত্রাশয়ের নমুনাগুলি সরানো হয়েছিল এবং আরও 4% প্যারাফর্মালডিহাইডে রাতারাতি 4 °C তাপমাত্রায় স্থির করা হয়েছিল, তারপর একটি নলাকার ব্লক তৈরি করতে 5% নিম্ন-গলনা-বিন্দু অ্যাগারোজ সহ একটি 0.8 ml সিরিঞ্জে এমবেড করা হয়েছিল এবং সহজে সক্ষম করা হয়েছিল। কোয়ার্টজ কিউভেট মধ্যে মাউন্ট. পুরো ব্লকটি ধীরে ধীরে মিথানল ব্যবহার করে ডিহাইড্রেটেড হয়েছিল: এইচ₂O 4 °C এ (30%:70% 1 h, 50%:50% 1 h, 70%:30% 1 h, 100%:0% 1 h এর জন্য, তারপর 100% মিথানল রাতারাতি এবং আবার 4 h) এবং অবশেষে বেনজাইল অ্যালকোহল-বেনজাইল বেনজয়েট (BABB) ইমেজিংয়ের জন্য প্রতিসরণকারী সূচক ম্যাচিং সমাধান হিসাবে নিমজ্জিত। বাণিজ্যিক লাল কণার সাথে সবুজ FITC ন্যানোবটের ভিট্রো তুলনা করার জন্য, আমরা ডায়াগনানো (ক্রিয়েটিভ ডায়াগনস্টিকস) লাল ফ্লুরোসেন্ট সিলিকা ন্যানো পার্টিকেল, 1 µm ব্যাস, BABB ক্লিয়ারিং প্রতিরোধী ব্যবহার করেছি।

অটোফ্লোরেসেন্স এবং পোলারাইজড এসএলএস ইমেজিং

হালকা-শীট ইমেজিং MacroSPIM-এ সঞ্চালিত হয়েছিল, IRB বার্সেলোনায় বিকশিত সম্পূর্ণ-অর্গান ইমেজিংয়ের জন্য একটি কাস্টম সিস্টেম^44,45. সংক্ষেপে, নমুনাগুলি একটি অ্যাগারোজ ব্লকে এম্বেড করা হয়, নমুনার সাথে একসাথে পরিষ্কার করা হয় এবং একটি কোয়ার্টজ কুভেটের ভিতরে চিত্রিত করা হয়। অটোফ্লোরোসেন্স ইমেজিং 488, 561 বা 638 nm এ লেজার ব্যবহার করে একটি 50 মিমি অ্যাক্রোম্যাটিক ডবলট নলাকার লেন্স (ACY254-050-A, Thorlabs) এর মাধ্যমে আলোকসজ্জা সরবরাহ করে। স্ট্রাইপ প্রত্নবস্তু কমাতে, আলোর শীটটি একটি অনুরণিত স্ক্যানার SC-10 (EOPC) এর সাথে একটি 4f টেলিস্কোপ বরাবর G322288322 100 mm অ্যাক্রোম্যাটিক ডবল লেন্স (QI অপটিক ফটোনিক্স) দিয়ে পিভট করা হয়। টিস্যু অটোফ্লোরেসেন্স ব্যান্ড- বা লং-পাস ফ্লুরোসেন্স ফিল্টারের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয় এবং একটি ORCA ফ্ল্যাশ v2 ক্যামেরা (হামামাতসু ফটোনিক্স) দিয়ে রেকর্ড করা হয়। একটি ×9.6 জুম, ×8 লেন্স এবং ×2 টিউব লেন্স সহ ×0.6 এ ইমেজিং করা হয়েছিল। আলোর শীটটি দৃশ্যের ক্ষেত্র জুড়ে চ্যাপ্টা ছিল, যার ফলে 5-6 µm অক্ষীয় রেজোলিউশন পাওয়া যায়। 3D ইমেজিং 2.5 µm ধাপে করা হয়েছিল। পুরো মূত্রাশয় ইমেজিং 2 × 3 বা 3 × 4 এ সঞ্চালিত হয়েছিল XY টাইলস, অঙ্গ আকারের উপর নির্ভর করে।

এসএলএস ইমেজিং ফ্লুরোসেন্স ফিল্টার অপসারণ করে বা লেজার প্রেরণকারী কোনও ফিল্টার ব্যবহার করে অর্জন করা হয়েছিল। লাইট-শীট পিভটিং লেজার স্পেকলের আওয়াজ কমিয়ে দেয়, যার ফলে লেজারের সামঞ্জস্যের সাময়িক গড় পূর্বে দেখানো হয়েছে⁵². আলোকসজ্জায় রৈখিক আলো-শীট মেরুকরণের অভিযোজন পিভট স্ক্যানারের আগে একটি অর্ধ-তরঙ্গ প্লেট (AHWP05M-600, Thorlabs) ঘোরানোর মাধ্যমে নিয়ন্ত্রিত হয়েছিল। শনাক্ত করা সংকেতটি একটি ঘূর্ণায়মান লিনিয়ার পোলারাইজার (LPVISC100, Thorlabs) ব্যবহার করে মেরুকরণে নির্বাচন করা হয়েছিল শনাক্তকরণে ফিল্টার চাকা, ফ্লুরোসেন্স সনাক্তকরণে> 50% তীব্রতা হ্রাস প্রবর্তন করে। পোলারাইজারের স্থিতিবিন্যাসের সাথে সাধারণভাবে এসএলএস সংকেত বন্টন পরিবর্তনের সময়, টিস্যু অটোফ্লোরেসেন্স সংকেত পোলারাইজারের ঘূর্ণন দ্বারা প্রভাবিত হয় না। sLS BABB-তে 2.4 ± 0.3 µm একটি স্থানিক রেজোলিউশন দেয়, যা ফ্লুরোসেন্স লাইট-শীট ইমেজিংয়ের রেজোলিউশনের সাথে তুলনীয় (একটি গাউসিয়ান ফাংশন ফিট করে নিশ্চিত করা হয়েছে XY একটি একক কণার চিত্র প্রতিক্রিয়া, পরিপূরক চিত্র। 8l–মি) এবং বাতাসে তাত্ত্বিক রেজোলিউশনের কাছাকাছি (সংখ্যাসূচক অ্যাপারচার সহ 1.53 µm (NA) = 0.2 সর্বাধিক ম্যাক্রো জুম ×8)।

চিত্র প্রক্রিয়াকরণ এবং 3D বিশ্লেষণ

ইমেজ প্রসেসিং, সেগমেন্টেশন এবং লাইট-শীট ডেটাসেটের বিশ্লেষণ ইমেজজে/ফিজির সাথে করা হয়েছিল, যখন ডুমুর। 3 এবং 4 ইমারিস ভিউয়ার 9.9 (https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer) এবং পরিপূরক ভিডিও 3 ইমারিস 9 দিয়ে তৈরি হয়েছিল (https://imaris.oxinst.com/) (বিটপ্লেন, অক্সফোর্ড ইন্সট্রুমেন্টস)। টাইল করা লাইট-শীট ডেটাসেটগুলি MosaicExplorerJ দিয়ে সেলাই করা হয়েছিল৷⁵³. ভার্চুয়াল মোডে বড় ভলিউমের আধা-স্বয়ংক্রিয় 3D টীকাটির জন্য কাস্টম ইমেজজে/ফিজি ম্যাক্রো ব্যবহার করে ব্লাডার টিস্যু 3D সেগমেন্টেশন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, একটি প্রথম স্ক্রিপ্ট, 'Macro1', 3D ইমেজ স্ট্যাকগুলি লোড করে, বেশ কয়েকটি প্লেনে ROI-এর ব্যবহারকারীর টীকা সক্ষম করে এবং 3D মুখোশ তৈরি এবং রপ্তানি করতে স্বয়ংক্রিয়ভাবে ROI গুলিকে ইন্টারপোলেট করে। যুক্তিসঙ্গত ন্যূনতম টীকা রাখার সময় ভাল সেগমেন্টেশন ধারাবাহিকতা সহজতর করার জন্য প্রতি 15টি প্লেনে (প্রতি 37.5 µm) ROI আঁকা হয়েছিল। একটি দ্বিতীয় স্ক্রিপ্ট, 'Macro2', গাণিতিক বা বুলিয়ান ক্রিয়াকলাপ সম্পাদন করে, পুরো স্ট্যাকগুলিকে মেমরিতে লোড না করে প্লেনে প্লেনে করে, হয় 3D মুখোশের মধ্যে বা একটি 3D মাস্ক এবং আসল ডেটার মধ্যে, ফলাফলটিকে একটি নতুন স্ট্যাক হিসাবে সংরক্ষণ করে। সমস্ত মুখোশ অটোফ্লোরোসেন্স চিত্রগুলি টীকা করে তৈরি করা হয়েছিল।

টিউমার এবং স্বাস্থ্যকর টিস্যু পৃষ্ঠের স্তর উভয়ই (চিত্র। 3) একটি মুখোশে মূত্রাশয়ের গহ্বরে ফিজির কাঠি এবং ল্যাসো সরঞ্জাম ব্যবহার করে চিত্রিত করা হয়েছিল। এই প্রথম পুনরাবৃত্তিকে BC1 বলে, পরবর্তীতে Macro1-এর রান তারপর স্বয়ংক্রিয়ভাবে এই 3D কনট্যুরটিকে একটি সংজ্ঞায়িত পিক্সেল পরিমাণ দ্বারা প্রসারিত করে যাতে নতুন মুখোশের পুনরাবৃত্তি, BC2, BC3 এবং আরও কিছু বৃদ্ধি পায়। টিউমার এবং স্বাস্থ্যকর টিস্যু উভয়ই সমন্বিত প্রথম স্তর, মাস্ক L1, BC1 থেকে মাস্ক BC2 বিয়োগ করে প্রাপ্ত করা হয়, যা L2 এবং L3 সমকেন্দ্রিক স্তর হিসাবে লাভ করে। গহ্বরের সবচেয়ে কাছের টিউমার ভলিউমটি একটি মাস্ক T1 তৈরি করতে কাঠি এবং ল্যাসো সরঞ্জাম দিয়ে টিউমারটিকে টীকা দিয়ে প্রাপ্ত করা হয়েছিল, যখন সুস্থ ইউরোথেলিয়াম 3D স্তরটি মাস্ক U1-এ আলাদাভাবে সনাক্ত করা হয়েছিল। L1 থেকে U1 বিয়োগ করলে টিউমারের পৃষ্ঠ স্তর পাওয়া যায়, এবং আরও: L2 − U1, L3 − U1। বিপরীতভাবে, ইউরোথেলিয়ামের প্রথম স্তরটি L1 থেকে T1 বিয়োগ করে পাওয়া যায়। চিত্রে সমস্ত স্তর। 3 33 µm পুরুত্ব থাকতে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল।

ম্যাক্রো এবং পদ্ধতির একই স্যুট (ইমেজজে ওয়ান্ড টুল, 500 µm এর ডিজিটাল ক্ষয় এবং তাই) মূত্রাশয় টিস্যুর অভ্যন্তরীণ অংশকে চিত্রিত এবং সেগমেন্ট করতে এবং তারপর মূত্রাশয়ের অভ্যন্তরীণ টিস্যুর ভলিউম অনুমান করতে ব্যবহার করা হয়েছিল (চিত্র। 4, বিস্তারিত জানার জন্য উপরে দেখুন)। বিক্ষিপ্ত সংকেত এবং মুখোশ একত্রিত করে ফিজিতে বিক্ষিপ্ত সংকেতের তীব্রতার হিস্টোগ্রাম তৈরি করা হয়েছিল।

RNT ব্যবহার করে ¹³¹আই-ন্যানোবট

টিউমার ইমপ্লান্টেশনের 8 থেকে 15 দিনের মধ্যে, প্রাণীদের ছয়টি গ্রুপে বিভক্ত করা হয়েছিল (গ্রুপ 1-6), গ্রুপ জুড়ে একই গড় টিউমার ভলিউম অর্জন করার চেষ্টা করে (সারণী) 2) পরীক্ষা-নিরীক্ষার জন্য, প্রাণীদের অ্যানেস্থেশিয়া দিয়ে প্ররোচিত করা হয়েছিল (বিশুদ্ধ O-তে 5% আইসোফ্লুরেন₂) এবং পেটের অঞ্চলে ম্যাসেজ করে মূত্রাশয় খালি করার আগে সুপাইন অবস্থান করুন। এর পরপরই, 100 µg ml এর ঘনত্বে উপযুক্ত চিকিত্সার 400 µl^-1 (সারণি 2) একটি 24-গেজ ক্যাথেটার ব্যবহার করে মূত্রাশয়ে প্রবেশ করানো হয়েছিল। ক্যাথেটার অপসারণের আগে চিকিত্সা এবং যানবাহন (জল বা ইউরিয়া) মূত্রাশয়ে 1 ঘন্টা থেকে যায়। তেজস্ক্রিয় দূষণ অপসারণের জন্য 24 ঘন্টা চিকিত্সার পর পশুর খাঁচা করাত প্রতিস্থাপন করে পেটের ম্যাসেজ এবং তাদের খাঁচায় ইঁদুরের অ্যানেস্থেশিয়া থেকে উদ্ধার করে মূত্রাশয়টি আবার খালি করা হয়েছিল।

থেরাপিউটিক কার্যকারিতা এমআরআই দ্বারা নির্ধারিত হয়

প্রতিটি মাউসের উপর দুটি এমআরআই স্টাডি করা হয়েছিল: (1) টিউমার ইনোকুলেশনের পরে 7 থেকে 14 দিনের মধ্যে প্রাণীদের দলগুলির মধ্যে এলোমেলো করে দেওয়া এবং প্রাথমিক (প্রিট্রিটমেন্ট) টিউমারের পরিমাণ পরিমাপ করা; (2) থেরাপিউটিক কার্যকারিতা মূল্যায়ন করার জন্য টিউমার ইনোকুলেশন (পরবর্তী চিকিত্সা) এর 16 থেকে 21 দিনের মধ্যে। MRI 7 T Bruker BioSpec এবং 11.7 T Bruker BioSpec স্ক্যানার (উভয়ই ParaVision 7 সফ্টওয়্যার সহ) ব্যবহার করে করা হয়েছিল, প্রাপ্যতার উপর নির্ভর করে। এটি ফলাফলগুলিকে প্রভাবিত করেনি কারণ বাহ্যিক ক্ষেত্রটি শারীরবৃত্তীয় ইমেজিংয়ের জন্য গুরুত্বপূর্ণ নয়¹⁴. ইমেজিং পরীক্ষাগুলি একই ইমেজিং পরামিতি এবং প্রক্রিয়াকরণ ব্যবহার করে পরিচালিত হয়েছিল যেমন উপরে ব্যাখ্যা করা হয়েছে (টিউমার আকার ট্র্যাকিং) 11.7 T স্ক্যানারের ক্ষেত্রে সেট-আপে অভ্যর্থনার জন্য একটি মাউস হার্ট সারফেস কয়েল এবং ট্রান্সমিশনের জন্য একটি ভলিউমেট্রিক কয়েল থাকে। প্রতিটি স্লাইসে টিউমার ভলিউম টিউমার এলাকা জুড়ে আগ্রহের ম্যানুয়ালি আঁকা ভলিউম থেকে নির্ধারণ করা হয়েছিল।

পরিসংখ্যান সংক্রান্ত বিশ্লেষণ

পিইটি ইমেজিং স্টাডিতে, টিউমার ভলিউম প্রতি ইনজেকশন ডোজ (% আইডি) এবং ইনজেকশনের ডোজ (% ID cm) শতাংশ^-³) একমুখী ANOVA ব্যবহার করে তুলনা করা হয়েছিল। টুকির একাধিক তুলনা পরীক্ষা ব্যবহার করে গ্রুপের মধ্যে পার্থক্য নির্ধারণ করা হয়েছিল। এনটিভি আরএনটি বিভাগে প্রাপ্ত হয়েছিল ক t- জোড়াবিহীন মান পরীক্ষা। ডেটা বিতরণ স্বাভাবিক বলে ধরে নেওয়া হয়েছিল, তবে এটি আনুষ্ঠানিকভাবে পরীক্ষা করা হয়নি। গ্রাফপ্যাড প্রিজম v.8 দিয়ে পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।